基于声响应支架的低强度组织碎化术用于肿瘤机械性破坏及免疫应答

《International Journal of Hyperthermia》：Low-intensity histotripsy based on acoustically-responsive scaffolds for tumor mechanical destruction and immune responses

　　

摘要

背景：机械消融可实现精确的非热性组织破坏，并具备坏死组织快速清除及肿块占位效应减压的优势。然而，高强度组织碎化术因靶向深度受限及成本较高而受到限制。

方法：研究人员提出了一种基于声响应支架（acoustically responsive scaffold, ARS）的低强度组织碎化术（low-intensity histotripsy, LIH）策略，用于肿瘤机械性破坏，并评估其消融效果及免疫调节潜能。共纳入25只荷VX2肿瘤的新西兰白兔，随机分为对照组、ARS组、LIH1组［脉冲重复频率（pulse repetition frequency, PRF）= 20?Hz，脉冲长度（pulse length, PL）= 5.37?ms + ARS］、LIH2组（PRF = 20?Hz，PL = 3.36?ms + ARS）和LIH3组（PRF = 38?Hz，PL = 5.37?ms + ARS），每组n = 5。

结果：与LIH2和LIH3相比，LIH1产生了更大的肿瘤损伤面积（31.83 ± 15.11?mm²）和损伤面积比（20.90 ± 7.07%），但差异无统计学意义。所有LIH组的组织损伤均显著大于ARS组（0.00052 ± 0.00055?mm²；0.0005 ± 0.00054%）和对照组（0.00 ± 0.00?mm²；0.00 ± 0.00%）。LIH治疗可显著抑制肿瘤生长（p < 0.05）。免疫荧光分析显示，LIH处理后肿瘤组织中CD8和CD11c表达增加（p < 0.05）。

结论：上述结果表明，LIH能够有效诱导肿瘤机械性破坏并增强抗肿瘤免疫应答。

该研究发表于《International Journal of Hyperthermia》，围绕低强度组织碎化术（low-intensity histotripsy, LIH）联合声响应支架（acoustically responsive scaffold, ARS）对实体瘤实施非热机械消融的可行性、安全性及免疫调节效应展开。研究背景在于，传统肿瘤消融技术虽然已广泛用于局部治疗，但多数方法依赖热效应，可能受到热沉效应、邻近重要结构损伤及消融边界不精确等限制。组织碎化术作为一种非热聚焦超声（focused ultrasound, FUS）机械消融策略，依赖空化泡云对组织进行粉碎性破坏，具备精准、快速清除坏死组织及减轻占位效应等优势。然而，常规高强度组织碎化术通常需要较大的换能器、较高的峰值负压（peak negative pressure, PNP）以及精确聚焦，这使其在深部肿瘤、声窗受限区域及伴随呼吸运动的病灶中应用受限，也增加了设备成本和临床操作难度。因此，开发一种在较低声压条件下仍能稳定触发空化、实现局部精准机械破坏的新策略，具有明确的临床转化价值。

基于上述问题，研究人员采用低频、低峰值负压的LIH方案，并通过肿瘤内注射ARS降低空化阈值。ARS包裹相变氟碳微粒，在低频低强度FUS照射下可发生汽化并诱发惯性空化，从而在靶区形成微泡云并实现局部机械消融。研究以新西兰白兔VX2皮下肿瘤模型为对象，比较不同声学参数组合下LIH的机械消融效果，并进一步初步评估其对肿瘤免疫微环境的影响。研究结论表明，该策略不仅能够在无明显热效应条件下造成显著的肿瘤组织机械性空腔样损伤和坏死，而且可抑制肿瘤短期生长，并促进CD8和CD11c相关免疫细胞浸润，提示其可能同时具有局部消融与免疫激活双重作用。这一结果的重要意义在于，为降低传统组织碎化术应用门槛、拓展其在实体瘤中的转化应用提供了实验依据，并提示机械消融可能成为肿瘤免疫调控的新切入点。

在技术方法方面，研究人员首先制备了温敏性ARS，即以20% F127形成可注射且具局部滞留特性的支架体系，并负载全氟戊烷微滴作为外源性空化核；随后建立新西兰白兔VX2皮下肿瘤模型，以二维超声引导肿瘤内注射ARS，并使用单阵元FUS换能器实施LIH处理。实验按不同PRF、PL参数分组比较机械消融效果，通过二维超声监测泡云与肿瘤体积变化，通过肉眼标本观察和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色评估损伤面积及坏死情况，并以免疫荧光检测CD8与CD11c表达，从而分析早期免疫反应。

研究结果部分可概括如下。

Temperature variations pre- and post-treatment
研究人员首先评估治疗前后温度变化，以确认该技术是否主要依赖机械效应而非热效应。红外测温显示，各组肿瘤表面温度在治疗后未升高，反而呈下降趋势。这一结果说明本研究采用的低频、低压FUS未产生可检测的热效应，从而支持LIH属于非热机械消融方式。该发现为后续组织破坏归因于空化介导的机械作用提供了基础证据。

ARS-induced bubble cloud formation with low-intensity FUS
为验证低强度FUS能否触发ARS汽化并形成泡云，研究人员利用显微镜、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和二维超声进行观察。ARS液滴平均直径为14.62 ± 16.88?μm，SEM显示颗粒大小分布相对均一，TEM显示其总体呈球形，直径约20?μm。二维超声结果表明，ARS注射后，ARS组与FUS + ARS组靶区均出现高回声区；治疗后，ARS单独注射组高回声区缩小或变化不明显，而FUS + ARS组高回声区显著扩大，并伴有声影形成。该结果说明在低强度FUS照射下，ARS可被有效激活，产生泡云并维持空化活动，这是实现低声压机械消融的关键前提。

Tumor growth rates with low-intensity histotripsy
研究人员进一步通过二维超声比较治疗前及治疗后72 h肿瘤体积变化，以评估LIH对肿瘤生长的影响。治疗前，各组肿瘤总体表现为均匀低回声伴局灶性高回声点。72 h后，LIH1、LIH2和LIH3组在肿瘤靶区出现局灶性不规则高回声区及明显声影，提示局部组织结构发生显著改变；ARS组虽可见边界清楚的高回声区，但无明显声影；对照组则无明显变化。体积分析显示，ARS组和对照组肿瘤体积明显增加，而LIH各组肿瘤增长缓慢，其中LIH1组甚至呈下降趋势。尽管LIH2与LIH3处理后体积仍有增加，但其增长率显著低于ARS组和对照组。研究据此认为，LIH可显著减缓肿瘤生长并在一定程度上抑制肿瘤进展，其中LIH1参数组合表现最佳。

Gross and pathological findings of the tumor 72?h post-treatment
为直接评价组织损伤，研究人员在治疗72 h后取材进行大体观察和HE染色。对照组大体及镜下均未见异常；ARS组仅见轻微空泡样改变，伴局部出血和炎性细胞浸润。相比之下，LIH1、LIH2和LIH3组均出现不同大小的空泡结构、组织坏死及炎性细胞浸润，大体上可见靶区形成明显空腔样损伤。定量分析显示，LIH1组肿瘤损伤面积为31.83 ± 15.11?mm²，损伤面积比为20.90 ± 7.07%；LIH2组分别为13.72 ± 7.32?mm²和8.27 ± 4.12%；LIH3组分别为20.45 ± 23.85?mm²和12.19 ± 9.07%。尽管LIH1与LIH2、LIH3之间差异未达统计学显著，但LIH1显示出更强的机械破坏趋势。ARS组损伤面积接近于零，与对照组无显著差异。此外，各组周围皮肤和肌肉组织未见明显肉眼损伤，提示该方法具有一定局部选择性和安全性。该部分结果明确证明，LIH能够在实体瘤内造成实质性的机械性破坏，而单纯ARS注射不足以产生相同效应。

Preliminary investigation into the immunological effects of LIH on tumors
在免疫效应方面，研究人员选择最优参数组LIH1，并与对照组及ARS组比较肿瘤组织内CD8和CD11c表达。免疫荧光结果显示，LIH处理后肿瘤组织中CD8和CD11c信号显著增强。CD8通常提示细胞毒性T淋巴细胞浸润增加，CD11c则与树突状细胞（dendritic cell）富集相关。该结果说明LIH除直接造成机械损伤外，还可能促进肿瘤抗原释放、抗原递呈及后续T细胞募集，从而诱导早期局部抗肿瘤免疫反应。虽然这一证据仍属初步，但它为LIH潜在的免疫调节价值提供了实验支持。

讨论部分主要围绕机制、疗效特点、免疫学意义及研究局限展开。研究人员认为，本研究首次证实LIH在实体肿瘤组织中同样能够实现有效机械消融，并对肿瘤免疫微环境产生调节作用。其机制基础在于：低峰值负压脉冲超声照射肿瘤内注射的外源性空化核后，可诱导泡云形成；持续照射进一步引发惯性空化，使组织碎裂为亚细胞结构，从而在较低PNP条件下实现原本需高强度组织碎化术才能达到的机械性消融效果。温敏性ARS则通过限制微粒扩散，提高了靶区内汽化与空化的空间可控性。研究同时指出，不同参数下疗效存在差异，PRF = 20?Hz、PL = 5.37?ms、PNP = 2.10?MPa为本实验中最优组合。对于LIH3组结果波动较大，作者仅指出可能与不同PRF对波传播和空化动力学的影响有关，尚需进一步研究澄清。

在肿瘤控制方面，研究人员强调，尽管本研究观察到的坏死范围尚不足以覆盖全部肿瘤体积，但LIH并未促进残余肿瘤细胞增殖，反而总体上抑制了肿瘤生长。部分亚组体积增加可能与未处理边缘残留肿瘤细胞继续增殖，以及空化诱导的短期炎性水肿有关，因此不能简单等同于治疗失败或肿瘤促进。免疫方面，研究结合既往组织碎化术文献指出，机械消融可释放损伤相关分子模式并增强吞噬细胞活化、抗原呈递和适应性免疫激活。本研究在72 h这一早期时间点观察到CD8与CD11c升高，与这一理论框架相一致，但尚不足以完整阐明其免疫机制，也未评价与免疫检查点治疗联用的潜力。作者还明确提出了若干局限，包括免疫研究仍属初步、缺少高强度组织碎化术或无ARS低强度超声对照、深部肿瘤瘤内精准注射仍具技术挑战、周围组织损伤缺乏系统评价、样本量较小，以及缺乏更长期随访。

研究结论部分可译为：本研究首次考察了LIH用于兔VX2肿瘤消融的疗效，并初步揭示其在调控肿瘤免疫微环境中的作用。结果证实，基于超声介导泡云技术的靶向组织消融是可行且耐受良好的，并具有较理想的安全性特征。治疗后72 h内观察到的免疫应答激活提示，LIH具有增强抗肿瘤免疫的较强潜力。总之，低强度FUS联合ARS可对实体瘤产生机械性破坏，并对肿瘤微环境发挥免疫调节作用。这些初步结果进一步提示，LIH可能启动免疫级联反应，值得开展进一步深入研究。