钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合态(holo)与脱钙态(apo)的双电子–电子双共振(DEER)结构研究

《International Journal of Radiation Biology》：Double electron-electron resonance (DEER) structural study of the holo and apo states of calmodulin

　　

目的：人钙调蛋白-1(CaM)发生钙依赖性的构象变化，由于其显著的结构柔性难以被捕获。本研究旨在表明双电子–电子双共振(DEER, double electron-electron resonance)谱学可测量CaM构象系综，并将最可几距离与实验结构及深度学习预测的结构模型进行比较。材料与方法：构建重组CaM的四种双半胱氨酸突变体用于位点定向自旋标记(site-directed spin labeling, SDSL)。分别在有Ca(II)(holo CaM)和无Ca(II)(apo CaM)条件下，用DEER谱学测定自旋标记的CaM。将测得的距离分布与来自蛋白质数据库(PDB)结构及AlphaFold2和IntFOLD7生成的模型预测值进行比较。使用DEERefiner以距离分布为约束对模型进行构象生成。结果：DEER得到的距离分布与构象异质性相符，apo与holo条件下距离分布不同。含Ca(II)的结果与包含经典晶体结构(1CLL)在内的CaM构象系综一致。apo态距离分布不能被现有模型很好地复现。用距离分布约束精炼后，模型与apo和holo结果的最可几距离吻合更好。精炼模型的比较表明Ca(II)结合引起EF-hand结构域间的细微重排。结论：四种双标记CaM变体的DEER衍生距离分布证明apo和holo CaM在冷冻溶液中占据宽泛但不同的构象系综。apo与holo分布的比较表明Ca(II)结合诱导微妙而显著的构象重排。结果说明DEER引导的建模可深入解析现有静态结构未能捕捉的柔性蛋白质系综。

论文解读：钙调蛋白结合态与脱钙态的双电子–电子双共振(DEER)结构研究

本文发表于《International Journal of Radiation Biology》。钙调蛋白(calmodulin, CaM)是一种单体、高度保守且普遍存在的钙结合信号蛋白，含两个由柔性中央连接肽相连的EF-hand结构域，可通过采样异质构象系综( conformational ensemble)发挥功能而非采用单一确定结构。经典的holo CaM晶体结构(PDB: 1CLL)呈伸展构象并具连续中央α螺旋，而apo CaM(PDB: 1CFD)中该螺旋被破坏；溶液NMR等研究表明中央螺旋高度动态或可断裂，使CaM呈现更紧凑或异质状态，不同于底物结合态(PDB: 2BBM)。X射线晶体学可能因晶格堆积稳定特定构象，NMR虽可探测动力学但对相对结构域取向精确定义受限，现有PDB单结构和AlphaFold2等深度学习预测均难以充分表征CaM固有的构象异质性与钙依赖的系综重分布。为此，研究人员采用双电子–电子双共振(double electron-electron resonance, DEER／PELDOR)谱学结合位点定向自旋标记(site-directed spin labeling, SDSL)及DEER约束的结构建模，在冷冻溶液中探测并比较apo与holo CaM的域间距离分布，以阐明Ca(II)结合对CaM构象系综的影响并验证DEER引导建模在柔性蛋白研究中的价值。

主要关键技术方法

研究人员以人CALM1基因(UniProt: P0DP23)构建pET14b表达载体，通过多位点筛选设计并在N-lobe(A10、T34)与C-lobe(T110、T146)引入双半胱氨酸突变，获得CaM 10₁₁₀、CaM 34₁₁₀、CaM 10₁₄₆、CaM 34₁₄₆四种双半胱氨酸变体；蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并经Ni亲和及尺寸排阻色谱纯化。采用MTSSL[ S-(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methyl methanesulfonothioate ]进行位点定向自旋标记，分别于含10 mM CaCl₂(holo)或10 mM EDTA(apo)及50% v/v甘油-d₈缓冲液中制备样品。使用Bruker ELEXSYS E580在Q-band(34 GHz)、50 K下以四脉冲DEER序列采集数据。距离分布分析采用DEERNet与DeerAnalysis2022；以AlphaFold2(AF2)和IntFOLD7(IF)预测野生型CaM结构，用chiLife进行in silico自旋标记及预测距离分布；以DEERefiner将实验DEER距离分布作为约束对PDB结构(1CLL、1CFD)及AF2、IF模型进行构象精炼，并用Flexible jFATCAT与TM-score评估结构差异。

研究结果

DEER data and distance distributions of the double cysteine variants of CaM（CaM双半胱氨酸变体的DEER数据及距离分布）

四种双标记CaM变体在apo(加EDTA)和holo(加CaCl₂)条件下均获良好双标记效率(由调制深度判断)。DEER衰减曲线显示调制特征，表明测得的是构象系综加权而非单一固定距离；含Ca(II)时146位标记变体的衰减曲线提示存在多距离群体贡献，即该位点构象异质性增加。经DEERNet分析所得距离分布均较宽，Ca(II)存在使四种构建体最可几距离发生明显偏移，尤以C-lobe T110标记变体最为显著——Ca(II)结合导致域间自旋标记距离增大。结果表明apo与holo CaM在冷冻溶液中均占据宽泛但不同的构象分布。

Comparison of DEER distance distributions with predictions from models（DEER距离分布与模型预测值的比较）

将PDB结构1CFD(apo)、1CLL(holo)及AF2与IF模型经chiLife虚拟自旋标记后预测的距离分布与实验DEER分布比较，发现1CFD不能很好复现实验apo分布，AF2预测具伸展中央螺旋近似1CLL，IF模型则偏紧凑近似1CFD；刚性TM-score显示AF2更接近1CLL，IF更接近1CFD，柔性jFATCAT表明差异主要来自N-/C-lobe绕连接肽的相对取向。直接用原始模型预测分布与实验偏差较大(apo平均绝对偏差MAD：1CFD 1.2 nm＞IF 0.8 nm＞1CLL 0.7 nm＞AF2 0.4 nm；holo MAD：1CFD 1.4 nm＞IF 1.2 nm＞AF2 0.5 nm＞1CLL 0.4 nm)。用DEERefiner以实验距离分布约束精炼后，各模型预测与实验最可几距离的偏差均减小(apo精炼后MAD：1CFD 0.4 nm＞IF 0.2 nm＝1CLL 0.2 nm＞AF2 0.1 nm；holo：1CFD 0.4 nm＞IF 0.3 nm＞1CLL 0.2 nm＝AF2 0.2 nm)，其中AF2起始模型经精炼后能同时较好符合apo与holo的主导距离群体。说明现有静态结构及单预测模型不能完全代表CaM的动态系综，但DEER约束精炼可生成与实验主导特征一致的构象代表体。

讨论与结论翻译

讨论指出CaM的DEER衍生距离分布较宽，反映溶液中的结构异质性与构象柔性；Ca(II)加入引起主导距离群体的偏移，代表构象系综内的重分布而非两个离散状态间的跃迁。AF2起始模型经DEERefiner分别施加apo与holo约束所得构象体间RMSD仅约0.254 nm、TM-score≈0.8，表明Ca(II)结合主要使系综群体偏移而非引发大规模折叠重排；apo CaM实测主导距离反而较接近伸展的1CLL结构而非紧凑的1CFD结构。经DEERefiner精炼的模型是与实验主导距离群体一致的构象代表而非唯一解结构。

结论：成功构建并自旋标记四种CaM双半胱氨酸变体，DEER测得域间距离分布与PDB结构及AlphaFold2、IntFOLD7模型预测比较，并以DEER距离分布约束用DEERefiner精炼获得与实验系综主导特征相符的构象代表体。apo与holo CaM在冷冻溶液中占据宽泛而不同的构象系综；Ca(II)结合主要引起构象群体重分布而非产生截然不同的结构状态，两种状态下均有相当比例的伸展域间排列，钙结合仅使系综发生细微偏移。本研究证明结合实验距离测量与先进结构建模可解析柔性蛋白的微妙构象状态，为后续在胞内、加结合伴侣等条件下开展CaM系综水平研究奠定基础。