色氨并吡咯酮衍生物g2通过调控PI3K/AKT/P53通路抑制舌鳞状细胞癌：来自体外与体内研究的证据

《Frontiers in Pharmacology》：The tryptanthrin derivative g2 suppresses tongue squamous cell carcinoma via PI3K/AKT/P53 cathway modulation: evidence from in vitro and in vivo studies

　　

摘要引言：舌鳞状细胞癌（TSCC）是一种常见且侵袭性强的口腔恶性肿瘤，预后较差且治疗选择有限，凸显了开发新型治疗药物的必要性。色氨并吡咯酮衍生物在多种癌症中已显示出良好的抗肿瘤潜力。本研究旨在评估一种新型色氨并吡咯酮衍生物g2对TSCC的抗肿瘤效能，并阐明其作用机制。

方法：研究人员首先在36种衍生物中，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法筛选g2对CAL-27和SCC9这两种TSCC细胞的细胞毒作用，并测定其半数抑制浓度（IC₅₀）。随后，采用一系列体外实验，包括划痕愈合实验、Transwell迁移实验、用于细胞凋亡和细胞周期分析的流式细胞术、转录组测序以及蛋白质印迹法（Western blotting），评估其对细胞迁移、凋亡、周期进程及其潜在信号通路的影响。为进行体内验证，研究人员将CAL-27细胞接种于裸鼠体内建立异种移植瘤模型，随后通过瘤内注射给予g2（10或20 mg/kg）处理。对肿瘤生长进行监测，并对收获的组织采用蛋白质印迹法进行分析。

结果与讨论：g2表现出最强的细胞毒性，对CAL-27和SCC9细胞的IC₅₀值分别为1.997 μM和2.134 μM。g2可显著抑制细胞迁移和侵袭，以剂量依赖方式诱导细胞凋亡，并导致S期细胞周期阻滞。转录组测序和蛋白质印迹分析显示，g2可激活PI3K/AKT/P53信号通路，其证据表现为PI3K/AKT下调以及P53上调。在体内，g2处理可明显抑制肿瘤生长，且未观察到可见的全身毒性，同时在肿瘤组织中证实了PI3K/AKT/P53通路的一致性调控。上述结果共同表明，色氨并吡咯酮衍生物g2在体外和体内均对TSCC具有显著抗肿瘤作用，其主要机制是调控PI3K/AKT/P53通路，提示其有望成为一种具有前景的治疗候选药物。仍需进一步研究以探索其更完整的机制谱及其在更广泛模型中的疗效。

该文发表于《Frontiers in Pharmacology》，围绕舌鳞状细胞癌（TSCC）这一临床上常见且侵袭性较强的口腔恶性肿瘤展开。TSCC在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中具有重要地位，在中国尤其常见，并且容易向头颈部淋巴结转移。现有治疗仍以手术为主，但术后常伴随言语、进食、呼吸功能受损及面容改变等问题，患者5年生存率仍低于50%。此外，舌体具有持续运动、血供丰富和淋巴网络发达等特点，使肿瘤更易复发和扩散。顺铂、氟尿嘧啶等现有药物疗效有限且毒副作用明显，因此开发新的高效、低毒、具有明确分子靶点的治疗候选物具有现实必要性。

在这一背景下，研究人员将天然产物色氨并吡咯酮（tryptanthrin）衍生化，构建并筛选一系列衍生物，试图从中发现对TSCC更具抑制活性的先导化合物。既往研究已表明，色氨并吡咯酮类化合物在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中具有抑制增殖、迁移和转移的作用，并可作用于多个致癌相关信号通路，因此其作为多靶点抗癌分子的潜力受到关注。本研究从36种衍生物中筛选出活性最优的g2，系统考察其对TSCC细胞恶性表型的影响及其分子机制，并进一步在动物模型中验证其体内抗肿瘤作用。

本研究主要采用的技术方法包括：以安徽医科大学提供的CAL-27和SCC9细胞为体外模型，利用CCK-8检测细胞活力并测定IC₅₀，通过划痕愈合实验和Transwell实验评价迁移能力，采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡并进行细胞周期分布分析；对g2处理后的细胞进行转录组测序，结合GO和KEGG富集分析筛选差异表达基因及相关通路，再以Western blotting验证PI3K/AKT/P53轴相关蛋白表达变化；体内部分采用BALB/c裸鼠CAL-27异种移植瘤模型，通过瘤内注射给予g2 10或20 mg/kg，并监测肿瘤体积、体重及肿瘤组织蛋白表达。

**3.1 Toxicity study of tryptanthrin derivatives on CAL-27 and SCC9 cells**
研究人员首先对36种色氨并吡咯酮衍生物进行统一浓度筛选，以CCK-8法比较其对CAL-27与SCC9细胞活力的影响。结果显示，第13号化合物g2表现出最强细胞毒活性，因此被确定为后续研究对象。进一步的剂量-效应实验表明，g2对CAL-27和SCC9细胞的IC₅₀分别为1.997 μM和2.134 μM，说明其对TSCC细胞增殖具有较强抑制作用。这一结果构成了后续功能研究和机制研究的基础，也提示g2是该系列化合物中最具开发潜力的候选分子。

**3.2 Compound g2 inhibits the migration of CAL-27 and SCC9 cells**
研究人员通过划痕愈合实验和Transwell迁移实验评估g2对TSCC细胞运动能力的影响。结果显示，g2处理后，CAL-27和SCC9细胞的划痕愈合能力下降，且随着浓度升高，迁移抑制作用增强；Transwell实验中，穿膜迁移细胞数也明显减少。文中还补充指出，与迁移能力下降相对应，g2可上调上皮标志物E-cadherin（CDH1），而对间质标志物Vimentin（VIM）和N-cadherin（CDH2）影响较小，提示该化合物可能促进细胞维持更偏向上皮样表型。综合来看，g2能够明显削弱TSCC细胞的迁移与侵袭相关能力。

**3.3 Tryptanthrin derivative g2 induces apoptosis of human TSCC CAL-27 and SCC9 cells**
在凋亡检测中，研究人员采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析不同浓度g2处理24 h后的细胞状态。结果表明，g2可增加CAL-27和SCC9细胞的凋亡比例，并呈剂量依赖趋势。该结果说明，g2不仅抑制细胞生长，还能主动诱导肿瘤细胞进入程序性死亡过程。结合其对P53蛋白的后续影响，可见凋亡诱导是g2抗TSCC作用的重要组成部分。

**3.4 Compound g2 arrests CAL-27 and SCC9 cells in the S phase**
细胞周期分析显示，g2处理后TSCC细胞周期分布发生明显变化。随着药物浓度增加，G1-S转换相关细胞比例下降，而S期细胞显著累积，提示g2诱导S期阻滞。文中进一步指出，在2 μM浓度下，SCC9细胞已出现明显的S期停滞现象。该结果说明，g2可通过干扰DNA复制相关阶段的周期推进来抑制细胞增殖，这与其在CCK-8实验中所观察到的生长抑制作用相互印证。

**3.5 RNA sequencing shows that g2 can activate the PI3K/AKT/P53 pathway**
为探索分子机制，研究人员对g2处理后的CAL-27和SCC9细胞进行转录组测序。结果显示，两种细胞中共有288个差异表达基因（DEGs）发生一致变化。GO与KEGG富集分析提示，g2影响的分子网络涉及PI3K-Akt信号通路以及与肿瘤进展、细胞黏附、免疫调控相关的多条通路。作者据此认为，g2可能并非单一靶点分子，而是通过多通路协同调控发挥抗肿瘤作用，其中PI3K/AKT/P53轴是最核心的机制线索之一。

**3.6 g2 can act on TSCC cells through the PI3K/AKT/P53 signaling pathway**
在蛋白水平验证中，研究人员采用Western blotting检测P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT和P53的表达变化。结果表明，g2处理后，CAL-27和SCC9细胞中PI3K及AKT相关蛋白表达下降，而P53表达上升，并呈剂量依赖趋势。这说明g2可抑制PI3K/AKT信号轴活性，同时增强抑癌蛋白P53相关信号，从而促进凋亡并抑制增殖。就机制层面而言，这一结果将转录组筛查得到的候选通路与细胞表型变化有效连接起来，构成了本研究的核心证据链。

**3.7 Antitumor effect of g2 in vivo**
在体内实验中，研究人员建立CAL-27裸鼠异种移植瘤模型，并于肿瘤长至约5 mm × 5 mm后给予g2瘤内注射。结果显示，与未处理对照组相比，10 mg/kg和20 mg/kg g2均能抑制肿瘤生长，且20 mg/kg抑制作用更强，提示其体内抗肿瘤效应具有剂量依赖性。与此同时，处理组体重未见明显下降，主要脏器苏木精-伊红染色亦未见显著病理改变，说明在该实验条件下未观察到明显全身毒性。对肿瘤组织进行免疫印迹分析进一步发现，g2同样可在体内下调P-PI3K、PI3K、P-AKT和AKT，并上调P53，且高剂量作用更明显。这说明g2在体内与体外具有一致的分子作用方向，从而增强了机制解释的可靠性。

讨论部分主要围绕TSCC治疗困境、色氨并吡咯酮衍生物的抗癌潜力以及PI3K/AKT/P53通路的重要性展开。研究人员指出，TSCC目前疗效提升受限，根本原因之一在于其分子机制尚未被充分解析，因此靶向关键信号通路的新药开发十分关键。文章结合既有文献指出，PI3K/AKT/P53通路与肿瘤发生、进展、治疗抵抗、侵袭转移和凋亡逃逸密切相关，是多种恶性肿瘤中的重要异常通路。P53作为经典抑癌转录因子，在恶性肿瘤中常发生缺失或突变，其介导的细胞衰老、凋亡及周期阻滞效应使之成为抗肿瘤治疗的重要节点。研究结果显示，g2在体外可抑制TSCC细胞活力、迁移和侵袭，诱导凋亡并导致S期阻滞；在体内则可抑制移植瘤生长且未见明显系统毒性。蛋白表达结果支持其通过下调PI3K/AKT信号并上调P53发挥作用。文章也明确指出了若干局限性，例如尚未直接评估其对正常细胞的选择性，凋亡机制证据仍可进一步扩充，PI3K/AKT与P53之间的因果层级关系仍需通过特异性抑制剂、激活剂或遗传学手段验证，此外仍需开展构效关系和更具转化意义的动物或临床相关模型研究。这些内容属于作者在原文中明确提出的限制与后续方向。

研究结论部分可译为：综上所述，本研究结果表明，色氨并吡咯酮衍生物g2通过多种机制对CAL-27和SCC9细胞发挥一致的抗肿瘤作用，这些机制包括抑制细胞迁移与侵袭、诱导细胞凋亡以及引发细胞周期阻滞。具体而言，研究人员发现g2可通过下调PI3K和AKT并上调P53及其磷酸化形式来调控PI3K/AKT/P53信号通路，从而激活凋亡机制以清除恶性细胞。综合体外与体内实验数据，g2可被视为一种具有前景的TSCC治疗候选物，提示其可能成为新的化疗药物，并为其未来临床开发提供了初步依据。