《Veterinary Research Communications》：Immune response in honey bees (Apis mellifera) following humic substance feeding
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腐殖质（Humic substances，HS）作为支持人类和动物健康的天然添加剂，正受到越来越多的研究关注，然而其对蜜蜂的影响仍缺乏充分表征。本研究评估了一种商品化HS制剂对西方蜜蜂（Apis mellifera）免疫与氧化状态的影响。新羽化工蜂在实验室条件
腐殖质（Humic substances，HS）作为支持人类和动物健康的天然添加剂，正受到越来越多的研究关注，然而其对蜜蜂的影响仍缺乏充分表征。本研究评估了一种商品化HS制剂对西方蜜蜂（Apis mellifera）免疫与氧化状态的影响。新羽化工蜂在实验室条件下饲养，并连续7天饲喂添加0.5% HS的糖浆，而对照组饲喂未添加HS的糖浆。研究人员通过分析选定免疫相关基因的表达、定量检测抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）、测定抗氧化酶活性、评估脂质过氧化水平以及表征血细胞群体组成来评价HS的作用。HS补充显著提高了超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，sod1）和前酚氧化酶（prophenoloxidase，proPO）的相对基因表达，而apidaecin和defensin 1基因的表达下降。与此同时，HS组过氧化氢酶（catalase，CAT）酶活性显著降低。其他AMPs的基因表达、AMPs的相对丰度以及其他抗氧化参数均未检测到显著变化。HS补充还显著提高了中等颗粒型血细胞的比例（p＜0.05），并伴随高颗粒型细胞比例下降（p＜0.01）。总之，在0.5%剂量下连续给予HS 7天并未对蜜蜂健康造成不利影响，但可调节部分免疫参数。这些免疫调节效应的生物学意义仍需通过病原挑战试验和自然条件下的田间试验进一步确认。
该论文发表于《Veterinary Research Communications》，聚焦腐殖质（Humic substances，HS）作为天然饲料添加剂对西方蜜蜂（Apis mellifera）免疫生理的影响。研究背景在于，蜜蜂是农业授粉和生态系统稳定的关键物种，但其持续受到病原体、农药、温度波动等生物性与非生物性胁迫。蜜蜂可通过体壁屏障、细胞免疫、体液免疫以及社会性免疫等多层级防御系统应对外界挑战。然而，在养蜂实践中，欧盟已禁止使用抗生素和磺胺类药物进行感染性疾病的防治，这推动了益生菌、益生元、植物源添加剂和腐殖质等天然物质的开发。既往研究已表明，HS在多种动物中具有解毒、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化和免疫调节等活性，但其在蜜蜂中的作用证据仍较有限。已有关于蜜蜂的研究更多集中于HS对繁殖力、寿命、生理状态、群势、蜂蜜产量或瓦螨控制的影响，而针对免疫应答与氧化稳态的系统评价相对不足。因此，本研究旨在明确商品化HS补充剂是否会影响蜜蜂免疫相关基因、抗氧化防御和血细胞组成，从而判断其作为健康促进性添加剂的潜在价值。
研究人员选取来自斯洛伐克Ko?ice兽医与药学大学3个蜂群的新羽化工蜂，在实验室条件下随机分为对照组与HS组，每组6个钢制蜂笼、每笼30只，共360只。HS组连续7天摄入含0.5% HS的蔗糖糖浆，对照组仅摄入普通糖浆。随后采集肠道、腹部与血淋巴样本，分别采用实时荧光定量PCR（qPCR，用于检测基因相对表达）、酶联免疫吸附测定（ELISA，用于定量抗菌肽）、FOX2与TBARS法（用于评估脂质过氧化）、抗氧化酶活性测定以及成像流式细胞术（imaging flow cytometry，用于血细胞分类）开展分析。样本来源、分组方式和检测指标设置较为明确，重点覆盖局部肠道转录水平、全身性体液指标与细胞免疫特征。
在研究结果方面，首先是“Relative gene expression”。研究人员检测了肠道中sod1、sod2、gst、tpx3、proPO、relish、abaecin、apidaecin、hymenoptaecin和defensin 1等基因的相对表达。结果显示，HS补充后，sod1基因相对表达显著升高（p＜0.01），proPO基因表达也显著升高（p＜0.05），提示局部抗氧化应答和黑化相关免疫途径受到激活。与之相对，apidaecin与defensin 1这两种抗菌肽相关基因的表达显著下降（均p＜0.05），说明HS对部分体液免疫转录反应具有调节作用。其余基因如sod2、gst、tpx3、relish、abaecin和hymenoptaecin未见显著变化，表明HS的影响具有选择性，而非对全部免疫和解毒相关通路产生广泛扰动。
其次是“Relative quantification of AMPs (ELISA)”。研究人员进一步在血淋巴中检测abaecin、defensin 1和hymenoptaecin三种抗菌肽的相对含量。结果显示，0.5% HS补充并未导致这些AMPs水平发生显著改变。也就是说，尽管局部肠道中部分AMP相关基因转录水平下降，但这种变化并未在系统性体液蛋白水平上得到同步体现。该结果提示，局部转录调控与全身蛋白丰度之间并非简单线性关系，HS在当前实验条件下并未表现出明确的体液免疫功能抑制效应。
第三部分是“Quantification of lipid peroxidation”。研究人员采用FOX2法检测脂质氢过氧化物（lipid hydroperoxides，LOOH），并采用TBARS法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，以评估腹部组织的脂质过氧化状态。结果表明，HS处理组在LOOH和MDA两个指标上均未出现显著变化。这说明在连续7天、0.5%剂量的补充条件下，HS并未诱导可检测的氧化损伤，也未破坏蜜蜂体内膜脂相关的氧化还原稳态。
第四部分是“Determination of catalase activity and superoxide dismutase activity”。研究人员测定了腹部组织中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性。结果显示，HS组SOD活性与对照组之间无显著差异，而CAT活性则显著下降（p＜0.05）。结合前述结果可见，肠道sod1基因转录升高并未转化为腹部整体SOD酶活增加；同时，尽管CAT活性下降，但脂质过氧化指标稳定，说明机体总体氧化平衡仍被维持。该结果支持作者提出的观点，即局部转录层面的变化未必会在系统性酶活层面直接呈现，且HS并未造成明显氧化应激损伤。
第五部分是“Representation of hemocyte populations”。研究人员利用成像流式细胞术，根据细胞大小、颗粒度和形态学特征，将血细胞划分为4类群体：小且极低颗粒度细胞、低颗粒度细胞、中等颗粒度细胞以及高颗粒度细胞。其中，不同群体分别主要对应原血细胞（prohemocytes，造血前体样细胞）、浆血细胞（plasmatocytes，主要参与吞噬）、颗粒细胞（granulocytes，含颗粒、参与吞噬和包囊）及可能的卵圆细胞样群体。比较发现，HS处理后中等颗粒度血细胞比例显著升高（p＜0.01），而高颗粒度细胞比例显著下降（p＜0.05），低颗粒度细胞则呈非显著下降趋势。该结果说明HS能够改变血细胞组成分布，提示其可能影响细胞免疫状态，尤其可能与吞噬或黑化相关细胞群体的动态变化有关。
在讨论部分，作者首先指出，抗菌肽是蜜蜂体液免疫的重要组成部分，其表达会受到细菌感染、病毒感染、外源化合物暴露等多重因素影响。本研究中apidaecin和defensin 1基因表达下降，提示HS可能在肠道局部转录层面调节免疫反应，但由于血淋巴中相关蛋白水平未下降，因此尚不能据此认定体液免疫功能被抑制。作者强调，这种“基因—蛋白不一致”可能与检测组织不同有关：基因表达分析针对肠道局部效应，而蛋白检测反映血淋巴中的系统性应答；此外，也可能与转录后调控或抗菌肽蛋白稳定性有关。
关于proPO，作者认为其表达升高提示HS可能增强与黑化反应相关的免疫潜能。proPO编码黑色素合成关键酶，在伤口愈合和免疫防御中具有核心作用。此前部分精油类添加剂和环境胁迫会降低proPO表达，而本研究则观察到相反变化，因此HS可能具有不同于其他添加剂的免疫调节模式。不过，作者也谨慎指出，转录水平升高是否最终转化为酶活增强，还需要进一步验证。
在抗氧化方面，作者认为SOD和CAT是蜜蜂抵御活性氧（reactive oxygen species，ROS）的重要酶系。HS使肠道sod1表达上调，提示局部抗氧化机制可能被激活；但腹部SOD活性未变、CAT活性下降，说明HS的作用并不简单表现为全身抗氧化酶全面增强。尽管如此，MDA和脂质氢过氧化物未发生变化，表明氧化还原稳态总体保持稳定，HS在该条件下并未造成氧化损伤。作者据此认为，HS不会扰乱蜜蜂体内氧化平衡，但连续7天补充未必是最佳给药策略，未来仍需比较不同持续时间和补充模式。
关于血细胞，作者强调昆虫血细胞分类至今缺乏统一标准，蜜蜂更是如此。成像流式细胞术可结合荧光、颗粒度、大小和形态学图像优势，提高血细胞分析精度。本研究观察到HS增加中等颗粒度细胞比例，并结合其他动物研究中HS促进吞噬活性的证据，作者认为HS可能同样影响蜜蜂的细胞免疫。由于该类群体中包含具有吞噬作用的浆血细胞和颗粒细胞，也包含与酚氧化酶产生相关的卵圆细胞样细胞，因此这一变化与proPO表达升高具有一定一致性。不过，作者并未过度外推，而是指出未来应进一步检测血细胞功能活性，尤其是吞噬能力，以确认其免疫学意义。
研究结论部分可译为：本研究表明，在实验室条件下连续7天补充0.5%腐殖质（HS）可调节蜜蜂免疫参数，且未见不良影响。HS提高了sod1和proPO基因表达，同时在肠道局部降低了apidaecin和defensin 1表达，但这些转录变化并未持续一致地反映为血淋巴或去除肠道后的腹部组织中蛋白或酶活性的改变。CAT活性显著下降，但氧化损伤标志物未发生变化，表明氧化还原稳态得到维持。HS还改变了血细胞组成。总体来看，0.5% HS补充对健康蜜蜂表现出较好的安全性；未来仍需通过时间梯度研究、剂量反应实验、不同补充方案比较、病原挑战试验以及田间验证，确定HS能否作为养蜂业中有效的健康促进型添加剂。
