季铵化合物-百里香酚组合的增强杀病毒活性：黏蛋白和黏膜粘附聚合物的影响

《Archives of Virology》：Enhanced virucidal activity of quaternary ammonium compound–thymol combinations: influence of mucin and mucoadhesive polymers

　　

COVID-19大流行凸显了口腔抗菌剂减少病毒传播的潜力。增强并持续口腔内抗病毒活性的策略可进一步支持呼吸道病毒的控制。在本研究中，研究人员在受控体外条件下评估了所选抗菌剂单独及组合使用对甲型流感病毒（IAV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的杀病毒活性。使用氯化十六烷基吡啶（CPC）、苄索氯铵（BZT）、百里香酚（thymol）和单宁酸（tannic acid）在黏蛋白（mucin）及代表性黏膜粘附聚合物存在下进行定量悬浮试验。通过动态光散射（DLS）和Zeta电位分析表征活性剂与黏蛋白或聚合物之间的相互作用。CPC、BZT和百里香酚表现出剂量依赖性病毒灭活。CPC在>200 μg/mL和25 μg/mL时分别将IAV和SARS-CoV-2滴度降低约4 log₁₀，而百里香酚在1000 μg/mL和750 μg/mL时实现相当水平的降低。单宁酸杀病毒活性微弱。值得注意的是，CPC-百里香酚和BZT-百里香酚组合在远低于单个活性剂浓度下实现>4 log₁₀的滴度降低，表明杀病毒活性增强且细胞相容性改善。黏蛋白显著削弱了CPC-百里香酚组合的杀病毒活性；然而，在富含黏蛋白的条件下，选定的聚合物部分保留了抗病毒效力。理化分析表明，静电、疏水和氢键相互作用共同促成这些效应。这些发现证明了季铵化合物-百里香酚组合的增强抗病毒活性，并突显了黏膜组分与大分子相互作用在调节口腔抗菌活性中的影响。

**研究背景与问题**
COVID-19大流行突显了口腔抗菌剂在降低呼吸道病毒传播中的潜力。多种呼吸道病毒（如SARS-CoV-2、甲型流感病毒IAV等）在鼻咽上皮复制并通过飞沫和气溶胶传播，口腔不仅是病毒的入侵门户，也是早期复制和传播的储库。常用口腔抗菌成分如氯化十六烷基吡啶（CPC，一种季铵化合物QAC）对包膜病毒表现出强杀病毒活性，但高浓度可能引起牙龈刺激等不良反应。因此，需要开发策略在维持杀病毒效力的同时降低有效浓度。天然植物化学物如百里香酚（thymol）和单宁酸（tannic acid）具有抗病毒活性，但将QAC与这些化合物组合的系统性研究尚缺乏。此外，口腔唾液中黏蛋白（mucin）等大分子成分可能通过静电等相互作用削弱阳离子抗菌剂的活性，而外源性黏膜粘附聚合物（如羧甲基纤维素钠NaCMC、聚乙烯醇PVA、羟乙基纤维素乙氧基季铵盐HECEQ）的加入可能改变局部理化环境，进而影响杀病毒效能。因此，研究人员开展本研究，旨在：(1) 测定CPC、BZT、百里香酚和单宁酸单独及组合的杀病毒活性；(2) 探究黏蛋白和选定黏膜粘附聚合物对杀病毒效力的影响；(3) 表征潜在的理化相互作用机制。论文发表在《Archives of Virology》。

**关键方法**
研究人员采用定量悬浮试验评估单一及组合活性剂对IAV和SARS-CoV-2的杀病毒活性（病毒株由英国剑桥大学兽医系提供）。通过动态光散射（DLS）和Zeta电位分析表征活性剂与黏蛋白（猪胃黏蛋白II型）及聚合物之间的相互作用。采用MTT试验评估细胞相容性（MDCK-II细胞和表达ACE2/TMPRSS2的Vero细胞VAT）。

**研究结果**

*Virucidal activity*
- **Control procedures**: 阳性对照证实IAV和SARS-CoV-2在MDCK-II和VAT细胞中产生典型细胞病变效应（CPE）。二甲基亚砜（DMSO）溶剂对照（0.5–5%）对病毒滴度无显著影响。细胞毒性检测确定各活性剂的最大非细胞毒性浓度，确保后续分析只使用低于细胞毒性阈值的稀释度。
- **Virucidal effect of individual active compounds**: CPC、BZT和百里香酚均呈剂量依赖性病毒灭活。对于IAV，BZT在200 μg/mL时降低约4 log₁₀ TCID₅₀/mL，CPC在相同浓度下降低2.5 log₁₀。对于SARS-CoV-2，CPC在25 μg/mL时降低约4 log₁₀，BZT在50 μg/mL时类似。百里香酚在1000 μg/mL（IAV）和750 μg/mL（SARS-CoV-2）时实现约4 log₁₀降低。单宁酸对IAV仅产生微弱活性（约1 log₁₀），对SARS-CoV-2活性中等但无明确浓度效应。
- **Virucidal effect of active compounds in combination**: 由于单宁酸活性有限，后续研究聚焦CPC-百里香酚和BZT-百里香酚组合。所有组合在暴露30分钟后均实现>4 log₁₀滴度降低，远高于单个活性剂在相同浓度下的效果。例如，25–50 μg CPC/mL与100 μg百里香酚/mL组合使IAV滴度降低>4.4 log₁₀，而单独50 μg CPC/mL仅降低<1 log₁₀。
- **Short exposure times**: 活性剂单独使用时需30分钟才能达到≥4 log₁₀降低，而组合在高浓度下2分钟内即可实现类似效果（如50 μg CPC/mL + 100 μg百里香酚/mL对IAV降低>4 log₁₀）。
- **Virucidal effect in the presence of mucin**: 黏蛋白（2 mg/mL）显著削弱CPC和BZT的活性，但对百里香酚影响较小。CPC-百里香酚组合在低CPC浓度（25 μg/mL）时活性大幅下降（IAV降低仅1.1 log₁₀），而在高CPC浓度（50 μg/mL）时活性基本保持（4.1 log₁₀），提示高浓度CPC可部分饱和黏蛋白结合位点。
- **Virucidal effect in the presence of mucoadhesive polymers**: 在仅含聚合物的体系中（无黏蛋白），CPC-百里香酚活性与缓冲液中相当。加入黏蛋白后，聚合物（PVA、NaCMC、HECEQ，各5 mg/mL）均部分恢复组合的杀病毒活性，其中NaCMC效果最佳，使IAV（50 μg CPC/mL）降低达4.8 log₁₀，SARS-CoV-2降低达1.2 log₁₀。

*Biocompatibility assessment*
CPC和BZT在100–200 μg/mL时细胞存活率降至20–30%，呈剂量依赖性细胞毒性。百里香酚在200 μg/mL以下维持>80%存活率，但≥400 μg/mL时急剧下降。CPC-百里香酚组合在大部分浓度下维持>80%细胞活力，优于BZT-百里香酚组合；后者在最高浓度（50 μg QAC/mL + 150 μg百里香酚/mL）时细胞活力显著降低至约72%（MDCK-II细胞）。

*Physicochemical characterisation*
- **pH measurement**: 所有体系pH保持在6.8–7.4生理范围内，加入CPC-百里香酚组合未引起显著变化。
- **Dynamic light scattering**: 黏蛋白单独存在时平均流体动力学直径为426.7 nm，多分散性指数（PDI）为0.394。加入50 μg CPC/mL后粒径显著减小至252.8 nm，PDI降至0.363，表明CPC与黏蛋白通过静电作用形成更均匀的复合体。百里香酚（100 μg/mL）对黏蛋白粒径无显著影响。CPC-百里香酚组合的效果取决于CPC浓度：50 μg CPC/mL时粒径减小效应与CPC单独相似；25 μg CPC/mL时粒径减小至364 nm；10 μg CPC/mL时无显著变化。在聚合物体系中，NaCMC和PVA存在下CPC诱导的粒径减小程度减弱，而HECEQ导致粒径增大至约500 nm。
- **Zeta potential**: 黏蛋白在DPBS中净负电荷为–9.6 mV。CPC（50 μg/mL）使Zeta电位显著降低至–6.38 mV，表明静电结合与部分电荷中和。百里香酚无影响。CPC-百里香酚组合中，Zeta电位随CPC浓度升高向中性偏移。在聚合物体系中，PVA和NaCMC不改变黏蛋白负电位，而HECEQ使电位反转为+5.3 mV，加入CPC后进一步升正。

**讨论与结论**
讨论指出，CPC和BZT作为阳离子表面活性剂，通过静电和疏水相互作用破坏病毒脂膜，而百里香酚作为两亲性酚类可通过插入脂质双层增加膜流动性和通透性。二者组合的增强杀病毒活性可能源于互补的膜破坏机制：百里香酚引起的脂质紊乱促进了QAC的更深层插入，而QAC介导的蛋白变性暴露了更多疏水域供百里香酚结合。这种协同作用使有效浓度降低数倍，并加速病毒灭活（2分钟内达>4 log₁₀），同时改善细胞相容性。SARS-CoV-2比IAV对活性剂更敏感，可能与SARS-CoV-2包膜富含磷脂、胆固醇少、流动性高，且表面刺突蛋白密度较低有关。黏蛋白通过与QAC发生多价相互作用（静电启动、疏水和氢键稳定）显著削弱其活性，而百里香酚因不带正电荷、与黏蛋白相互作用弱而活性受影响较小。聚合物通过空间位阻、竞争性结合或改变结合动力学部分保护CPC-百里香酚活性，其中阴离子NaCMC因优先与QAC形成瞬时复合体、减少其被黏蛋白结合而效果最佳。研究结论翻译：本研究显示，CPC、BZT和百里香酚对两种包膜呼吸道病毒IAV和SARS-CoV-2均具有强杀病毒活性。值得注意的是，研究发现百里香酚可增强QAC的杀病毒效力，使在体外测试条件下以远低于单一QAC所需的浓度实现≥4 log₁₀的病毒滴度降低。这种增强活性加速了病毒灭活，在数分钟内实现约4 log₁₀降低，同时改善了细胞相容性。主要唾液糖蛋白黏蛋白的存在削弱了QAC活性，而百里香酚基本保持效力。在富含黏蛋白的条件下，选定的聚合物部分保留了杀病毒活性，但程度各异，突出了在更复杂且具生理代表性的系统中评价抗病毒制剂的重要性。这些发现强调了黏膜组分和大分子如何调节抗病毒效力，并可能为未来维持黏蛋白存在下抗病毒活性的策略提供依据；然而，仍需在更符合生理的模型中进行进一步研究。