印度辣椒(Capsicum annuum)上辣椒卷叶病毒(Begomovirus chillicapsici，ChiLCV)与澳洲候选植原体(Candidatus Phytoplasma australasiaticum)复合侵染的分子特征研究

《Discover Plants》：Molecular characterization of Candidatus Phytoplasma australasiaticum strain causing mixed infection with chilli leaf curl virus (Begomovirus chillicapsici) on Capsicum annuum in India

　　

摘要：辣椒(Capsicum annuum L.)栽培受病毒与植原体重度威胁，常造成显著减产。研究人员在印度泰米尔纳德邦农业大学哥印拜陀校区田间调查发现，辣椒植株同时表现双生病毒(Begomovirus)典型症状（叶片向上卷曲、皱缩）与植原体典型症状（丛枝症，witches' broom）。分子检测证实供试样品中存在辣椒卷叶病毒(Begomovirus chillicapsici—ChiLCV)及'Candidatus Phytoplasma australasiaticum'。序列分析与系统发育分析显示，ChiLCV与卡纳塔克邦及安得拉邦分离物高度相似，而所检出植原体聚类于16SrII-D亚组；虚拟RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)分析进一步验证了该亚组分类。研究结果表明辣椒上存在Ca. P. australasiaticum与ChiLCV的复合侵染，强调了病原互作的复杂性及分子诊断技术在识别复合侵染中的重要意义。

论文解读——印度辣椒上辣椒卷叶病毒与澳洲候选植原体复合侵染的分子表征研究

一、研究背景与意义

辣椒(Capsicum annuum L.)是具有重要经济价值的蔬菜及香料作物，印度是全球最大的辣椒生产、消费和出口国。辣椒生产受到多种植物病原的严重威胁，其中由粉虱(Bemisia tabaci)传播的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus，双生病毒科Geminiviridae)引起的辣椒卷叶病(Chilli leaf curl disease，由Chilli leaf curl virus，ChiLCV所致)可造成高达100%的经济产量损失；而植原体(Phytoplasma，柔膜菌门Mollicutes，限于韧皮部生活的植物病原原核生物，未获纯培养，以'Candidatus Phytoplasma' spp.命名)亦可在辣椒上引起小叶病(little leaf)及丛枝症(witches' broom)。以往印度已有辣椒受Ca. P. trifolii、Ca. P. asteris及Ca. P. australasia-related strain单独侵染的报道，也有ChiLCV与Ca. P. trifolii复合侵染辣椒的记录。然而植原体与病毒复合侵染的症状常相互混淆，仅靠表型难以区分，且不同病原组合可产生更复杂的病理后果。目前尚无Ca. P. australasiaticum(16SrII-D亚组)与ChiLCV在辣椒上自然复合侵染的分子学证据。为此，研究人员在印度泰米尔纳德邦开展田间调查与分子检测，旨在明确辣椒上ChiLCV与Ca. P. australasiaticum复合侵染的存在并进行分子特征分析，为理解此类跨类群复合侵染的流行病学提供依据。该研究成果发表于《Discover Plants》。

二、主要关键技术方法

研究人员于泰米尔纳德农业大学哥印拜陀试验田辣椒种植区开展田间调查，采集表现向上卷曲、皱缩及丛枝症状的20份代表性植株样品及无症状对照。采用CTAB法提取总基因组DNA，经Nanodrop定量(A_260/280＞1.8)后：①用Begomovirus简并引物PALr772/PALc1960扩增DNA-A组分外壳蛋白(coat protein，CP)区约1.2 kb片段进行病毒检测；②对Begomovirus阳性样品先行巢式PCR(nested PCR)，第一轮用植原体通用引物P1/P7扩16S rRNA基因，第二轮用R16F2n/R16R2n扩约1.2 kb内段检测植原体；③将阳性PCR产物胶回收、克隆至pGEM^?-T easy载体并转化E. coli DH5α，双向测序；④BLAST比对、CLUSTALW比对，MEGA 7.0软件邻接法(Neighbor-Joining，NJ)建系统发育树(1000次自举检验)；⑤用iPhyClassifier进行16S rRNA基因虚拟RFLP分析，比对参比株确定16Sr分组/亚组。

三、研究结果

3 Results

供试20份表现向上卷曲伴丛枝症状的样品中，9份经PCR及巢式PCR双重阳性，确认存在病毒与植原体自然复合侵染。Begomovirus特异引物扩出预期~1.2 kb条带，巢式PCR用R16F2n/R16R2n也扩出~1.2 kb植原体16S rRNA片段，健康对照无扩增。

Begomovirus CP基因序列(GenBank登录号OR682569)经BLAST显示与ChiLCV卡纳塔克邦分离物(MW760322，98%同源)及安得拉邦分离物(MN417111，98%同源)相似性最高，与棉花(KY20137)、番木瓜(GU136803)分离物为97%。系统发育树中该研究分离物与其他印度ChiLCV辣椒分离物聚为一支，确认为Begomovirus chillicapsici(ChiLCV)。

植原体16S rRNA部分序列(GenBank登录号OP351638、OP358991)与Ca. P. australasiaticum芝麻(OL306323)、番茄(JQ868448)、番木瓜(Y10096)、苋菜(ON611696)分离物同源性达99.88%。iPhyClassifier虚拟RFLP分析(AluI、BamHI、BfaI、BstUI、DraI、EcoRI、HaeIII、HhaI、HinfI、HpaI、HpaII、KpnI、MboI、MseI、RsaI、SspI、TaqI共17种酶)显示与16SrII-D参比株(Y10097)相似系数F=0.99，判定为16SrII组D亚组(16SrII-D)，即Candidatus Phytoplasma australasiaticum。系统发育树中该分离物与花生丛枝植原体(Peanut witches' broom phytoplasma，16Sr-II组)聚为一簇，且与该组16SrII-D参考序列亲缘最近。

综合上述结果，研究人员确认所采集辣椒样品中存在Ca. P. australasiaticum(16SrII-D)与Begomovirus chillicapsici(ChiLCV)的自然复合侵染，此为印度辣椒上该组合的首次报道。

四、讨论与结论总结

此前印度辣椒已有Ca. P. australasia-related strain致花器变绿(phyllody)及Ca. P. trifolii致丛枝症的单独或与ChiLCV复合侵染报道，但Ca. P. australasiaticum(16SrII-D)与ChiLCV在辣椒上的共存未见记录。本研究通过分子检测与序列、系统发育及虚拟RFLP分析证实了这一新复合侵染模式。植原体16S rRNA基因序列与已定名Ca. P. australasiaticum分离物＞98.65%相似度符合物种界定阈值，虚拟RFLP图谱与16SrII-D参考株一致。由于病毒与植原体复合侵染往往加重症状严重度与产量损失，并可能影响介体昆虫适合度及传播效率，此类跨类群复合侵染日益受到关注。本研究拓展了该植原体的已知寄主范围，揭示印度辣椒产区存在更为复杂的病原互作格局，强调分子诊断在复合侵染识别中的必要性，也为后续探究病毒—植原体—介体—寄主互作及制定防控策略奠定基线。

结论(译文)： 本研究首次提供了辣椒(Capsicum annuum)上'Candidatus Phytoplasma australasiaticum'与辣椒卷叶病毒(Begomovirus chillicapsici)复合侵染的证据。该复合侵染此前未见报道，拓展了此种植原体的已知寄主范围，并提示其在印度条件下辣椒上的潜在新兴危害。病毒与植原体的复合侵染因可增强病害严重度、形成侵袭性病害复合体及改变流行学动态而日益受到重视，此类互作可能影响病毒进化、修饰症状表现并影响介体(如粉虱)适合度从而重塑田间传毒效率。未来需深入解析复合侵染对病原遗传多样性、重组率、选择压力及进化轨迹的影响，并开发有效措施以减轻其对作物生产的威胁。