利用优化施用的Diamond Nucleic Acid Dye?(DD)评估多种基材上触摸沉积物(touch deposits)中细胞的存留(persistence)

《International Journal of Legal Medicine》：Persistence of touch deposits on a range of substrates assessed using an optimised application of Diamond Dye?

　　

摘要：生物材料在各种基材上较长时间的存留(persistence)及细胞降解的可视化是DNA-TPPR（DNA Transfer, Persistence, Prevalence, Recovery，DNA转移、存留、普遍存在性及回收率）研究中的重要考量方向。本研究调查了触摸沉积物(touch deposits)中细胞的长期存留情况及其在不同基材上的可视化能力，重点在于优化Diamond Nucleic Acid Dye?（DD，金刚石核酸染料）的施用方法，在最小化对细胞扰动的同时确保有效的细胞可视化。研究人员测试了三种喷雾方式及七个喷射距离，依据荧光强度和沉积圈外细胞材料扩散程度评估效果。采用优化方法评估了六种基材——玻璃、塑料、三聚氰胺(melamine)、铝、皮革和棉布——上触摸细胞的存留情况，检测时间点长达一年，并考察了重新喷雾(re-spraying)的影响。结果显示不同基材间细胞存留呈递减且存在显著差异，棉布和皮革存留最低。此外，重新染色结果表明，初次染色后随时间推移，需在物品上再次喷洒DD以确保细胞物质的最佳可视化。随后对沉积物中DNA量的测定显示，回收的DNA量远低于基于细胞计数所预期的量。本研究为法医案件人员根据基材特异性细胞存留情况优先（在可能情况下）进行样本采集提供了有价值的基线数据，并有助于建立DD最佳施用方案以最大化可视化效率并最小化细胞扰动。

论文解读：利用优化施用的Diamond Nucleic Acid Dye?评估多种基材上触摸沉积物中细胞的存留

研究背景与意义

在法医遗传学尤其是DNA-TPPR（DNA Transfer, Persistence, Prevalence, Recovery；DNA转移、存留、普遍存在性及回收率）研究中，生物材料（如触摸DNA/touch DNA）在不同基材(substrate)上的存留(persistence)及降解可视化直接影响证据价值评估。基材的表面形貌(topography)、粗糙度、润湿性(wettability)及化学相互作用均影响细胞的沉积、附着与存留；多孔、粗糙表面易截留细胞，而疏水表面可能排斥含水生物成分。此外，温湿度等环境因素可加速DNA降解或丢失。目前虽已有Diamond Nucleic Acid Dye?（DD，金刚石核酸染料）用于触摸沉积物可视化的报道，但缺乏针对DD在不同基材上施用优化及长期存留结合荧光衰减、再染色(respraying)效应的系统研究，且未知初次染色后荧光能维持多久及可否通过再染色恢复信号。因此，研究人员开展了此项研究，旨在优化DD连续喷雾施用参数，量化六种常见基材（玻璃、塑料、三聚氰胺板、铝、皮革、棉布）上触摸细胞长达12个月的存留趋势，评估荧光衰减及再染色对可视化的改善作用，并比较可视细胞数与12个月后回收DNA量的关系。该研究成果为法医物证检验中的检材优先级排序及DD标准化操作提供实验依据，论文发表于《International Journal of Legal Medicine》。

主要关键技术方法

研究人员以单一名受试者洗净手后自然分泌的拇指触摸沉积物(touch deposit，直径约11 mm圆环限定)为样本来源，在六种深色或背景对照基材上制作5次重复沉积。核心方法包括：①DD喷雾优化实验——以载玻片为基材，比较单次/双次香水瓶喷雾与连续喷雾装置(Voilamart?空气压缩机，约2秒)在3–20 cm七种距离下造成的细胞位移（沉积圈外细胞数）及荧光强度，筛选最小扰动条件；②长期存留评估——采用优化条件（连续喷雾，距基材20 cm）染色，在0 h至12个月间20个时间点用数码显微镜(DinoLIGHT)采集荧光图像，经ImageJ软件（设定特定圆度0.6–1.0及各基材专属像素阈值、去斑点）计数可见细胞，以各重复最高细胞数为基准计算存留百分比；③于6个月及12个月时对样本再施DD并重新成像，评估再染色增益；④12个月后以湿-干拭子法(wet-dry swabbing)收集DNA，经PrepFiler?提取、Quantifiler Trio?定量，比较细胞计数与DNA回收量。统计采用Shapiro-Wilk正态性检验、ANOVA及Friedman检验。

研究结果

Spray device and application optimisation（喷雾装置与应用优化）

比较三种喷雾方式及不同距离发现，单次香水瓶喷雾导致最多细胞位移（平均51个圈外细胞），连续喷雾装置在20 cm距离时细胞位移最小（平均约14个）。喷雾距离越近位移越多，3 cm连续喷雾位移显著多于其余距离（p ≤ 0.05）。香水瓶喷雾存在液滴大、分布不均问题；连续喷雾覆盖更均匀。最终确定连续喷雾装置距样品20 cm为推荐优化施用条件，可在小目标区域减少细胞丢失与位移。

Touch cell persistence on different surfaces over time（不同表面触摸细胞随时间的存留）

初始染色后部分基材细胞可视化数在24 h内略有上升，提示染料渗透与DNA结合具时间依赖性。之后各基材细胞可视化比例逐渐下降，6个月（再染色前）尚可观察初始沉积的5%–32%。存留由高到低趋势为：玻璃 > 塑料 > 铝 > 三聚氰胺(melamine) > 皮革 > 棉布（melamine、cotton、leather存留最低，glass、plastic、aluminium相对较好）。平滑非多孔表面（玻璃、塑料、铝）较粗糙/多孔表面存留更好，后者可能因接触面积少或细胞陷入沟壑无法被DD染色。各基材存留下降均具统计学显著性（p < 0.05）。

Re-application of Diamond Dye? to enhance visualisation for targeted sampling（再施DD增强可视化）

6个月再染色使所有基材细胞可视化平均提升48%（p < 0.05）；12个月再染色平均提升14%，其中玻璃、塑料、皮革达显著水平（p < 0.05）。表明荧光衰减部分源于染料光漂白或结合减弱而非全部细胞真实丢失，适时再施DD可恢复部分可视化效果，但再染色本身可能造成轻微细胞损失需权衡。

Cell counts and quantification results comparisons（细胞计数与定量结果比较）

12个月后DNA回收量分别为玻璃0.004 ng、塑料0.013 ng、三聚氰胺0.008 ng、铝0.010 ng、棉0.032 ng、皮革0.008 ng，远低于按平均每细胞6 pg DNA及可视细胞数推算的预期值（低67%–99%）。线性回归无显著关联（R2极小），说明回收DNA量与可视细胞计数不相关，推测系touch DNA本身高度降解、提取回收率差异及DD结合非人源核酸等因素所致。

讨论与结论翻译

研究表明，使用连续喷雾装置距20 cm施用DD对细胞扰动最小且染色均匀；荧光摄取与维持具基材依赖性，部分表面最大荧光延迟至染色后24 h出现，各基材荧光大幅衰减时段不同；定期再染色可改善长期存放后细胞物质的可视化。粗糙多孔基材随时间存留下降幅度大于非多孔基材。未来应进一步探究表面形貌、化学组成、官能团及疏水性对沉积细胞及DD染色的交互影响，并扩展STR分型与细胞计数关联性研究。基于上述发现，法医人员在初期检材分拣(vetting)时应综合考虑检材类型关联的潜在细胞存留损失——即便检材物证价值高，若属低存留基材（如棉布、皮革），亦应优先安排检验以防证据丢失。

（结论原文浓缩翻译：This study investigated the persistence of touch cells on six common surfaces over a period of one year while also assessing the utility of Diamond Dye? cell visualisation method for this purpose, including method optimisation. [...] Based on these findings when triaging exhibits for examination during the initial stages of the investigative process the vetting personnel should consider, not just the probative value of an exhibit, but also the potential losses associated with each item type.）