犬细小病毒2型(CPV-2)重组假病毒(pseudovirus)表达系统的开发：一种潜在的疫苗平台

《Veterinary Research》：Development of canine parvovirus-2-based recombinant pseudoviruses expression system: a potential vaccine platform

　　

摘要：犬细小病毒-2(Canine parvovirus-2, CPV-2)与犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)是危害犬科及各种食肉动物的高度感染性、高致病性病原体，临床中常发生混合感染。尽管商用减毒活疫苗已广泛用于预防这两种病毒感染，但仍存在生物安全性问题及对新型变异株保护力不足等缺陷，因此亟需新型疫苗。本研究基于CPV-2全长感染性克隆(infectious clone)开发了重组CPV-2假病毒(pseudovirus)表达系统，发现表达CDV H蛋白(血凝素蛋白，Hemagglutinin protein)的重组CPV-2假病毒能有效保护犬只抵御CPV-2与CDV感染。研究人员首先基于CPV-2骨架设计了重组假病毒载体，并建立了稳定生产携带外源基因的CPV-2重组假病毒的细胞系统。这些假病毒保留了天然CPV-2的形态与粒径，维持了对猪红细胞的血凝活性(hemagglutination activity)，并能有效感染敏感细胞并表达所携带的外源基因。随后，研究人员制备了表达CDV H蛋白的重组CPV-2假病毒(CPV–CDV重组假病毒)，该假病毒在犬体内诱导了有效的细胞免疫与体液免疫应答。CPV–CDV免疫犬血清能有效中和敏感细胞中的CPV-2及CDV感染。重要的是，CPV–CDV能对CPV-2和CDV攻毒挑战提供完全保护。综上所述，研究人员成功开发了稳定的CPV-2重组假病毒生产系统，具有作为疫苗平台开发的巨大潜力。

基于犬细小病毒-2(CPV-2)重组假病毒表达系统的犬瘟热病毒(CDV)二价疫苗平台研究解读

本文发表于《Veterinary Research》，针对当前犬细小病毒-2(Canine parvovirus-2, CPV-2)与犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)商用减毒活疫苗存在的生物安全风险（残存毒力、毒力返祖、环境传播）及对新兴抗原变异株保护力不足的问题，研究人员利用前期已构建的CPV-2全长感染性克隆(infectious clone, pX-CPV-2c)，通过基因工程手段将CPV-2 VP2编码区替换为外源基因（报告基因EGFP或CDV H基因），并构建稳定表达CPV-2结构蛋白VP1和VP2的HEK293^capsid包装细胞系，开发了复制缺陷型重组CPV-2假病毒(pseudovirus)表达系统，并以表达CDV H蛋白的二价假病毒(CPV–CDV)在犬模型中验证了其能诱导强效体液与细胞免疫应答并提供完全攻毒保护，证明该系统可作为新型多价疫苗平台。

主要关键技术方法：

研究人员以自建CPV-2全长为骨架，通过重叠PCR扩增融合5′非翻译区(5′UTR)的VP1/VP2序列并克隆至真核表达载体构建包装质粒(pCI-VP1/pCI-VP2)；用慢病毒感染法筛选建立稳定共表达CPV-2 VP1（嘌呤霉素筛选）和VP2（G418筛选）的HEK293^capsid细胞系；将VP2编码框起始密码子ATG下游插入外源基因(EGFP或CDV H)构建转移质粒，转染HEK293^capsid细胞生产重组假病毒并经蔗糖密度梯度超速离心纯化；通过透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、血凝试验及F81细胞感染实验鉴定假病毒形态、大小与功能；通过不同长度外源片段插入测定基因组包装容量；动物实验采用25只4周龄比格犬(Beagle)随机分5组（3个剂量CPV–CDV假病毒组、商品苗对照组、PBS对照组），肌肉注射免疫3次（0、3、6周），8周时进行CPV-2(1×10⁶TCID₅₀)和CDV(1×10⁷TCID₅₀)联合攻毒，检测血清特异性IgG及中和抗体、IgG亚类(IgG1/IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10)、B/T细胞表位识别及攻毒后存活率与排毒量。

研究结果：

Construction of trafficking and packaging plasmids for recombinant pseudovirus based on CPV-2（基于CPV-2的重组假病毒转运及包装质粒的构建）：

研究人员将CPV-2感染性克隆中VP2编码区自起始密码子ATG后替换为EGFP基因构建转移质粒pCPV-EGFP，同时构建融合CPV-2 5′UTR的VP1和VP2真核表达包装质粒pCI-VP1/pCI-VP2。Western blot及免疫荧光证实各质粒在HEK293细胞中有效表达相应蛋白，表明外源基因转运质粒及CPV-2衣壳蛋白包装质粒构建成功。

Production and identification of recombinant CPV-2 pseudovirus using the trafficking and packaging plasmids（利用转运及包装质粒制备与鉴定重组CPV-2假病毒）：

将pCPV-EGFP与pCI-VP1/pCI-VP2共转染HEK293细胞，收获上清经TEM观察假病毒颗粒(CPV-EGFP-T)形态与天然CPV-2相似，DLS显示直径20–30 nm，血凝活性保留（效价低于野生型），感染F81猫肾细胞后可表达EGFP。证实三质粒共转染系统可组装出具有天然CPV-2物理特征和感染功能的重组假病毒。

Construction of a stable cell line for the recombinant CPV-2 pseudovirus production（构建用于重组CPV-2假病毒生产的稳定细胞系）：

通过慢病毒转导与抗生素筛选获得稳定表达VP1的HEK293^VP1细胞，再感染VP2慢病毒获得双表达VP1/VP2的HEK293^capsid细胞系，生长曲线与野生型无差异。单转染pCPV-EGFP至HEK293^capsid即可产出重组假病毒CPV-EGFP，效价达1×10^8.6TCID₅₀/mL，血凝效价1:2⁸，感染F81细胞高效表达EGFP。表明HEK293^capsid细胞系可用于单质粒转染便捷生产重组CPV-2假病毒。

Packaging capacity of the recombinant CPV-2 pseudovirus for exogenous genes（重组CPV-2假病毒对外源基因的包装容量）：

构建插入片段长度为VP2编码区57%、80%、100%、120%、140%（对应基因组总长为CPV的85%–114%）的系列转移质粒，转染HEK293^capsid后qPCR检测上清病毒基因组拷贝数。结果表明当外源插入片段为1400–2100 bp（总基因组4600–5300 nt）时包装效率最高，过长或过短均显著降低产毒量，确定CPV-2假病毒适宜外源基因插入范围为1400–2100 bp。

Recombinant CPV-2 pseudovirus expressing CDV H protein induces efficient humoral immune responses against both CPV-2 and CDV（表达CDV H蛋白的重组CPV-2假病毒诱导针对CPV-2和CDV的有效体液免疫应答）：

将CDV H基因替换VP2构建pCPV–CDV并转染HEK293^capsid制备CPV–CDV假病毒。犬免疫实验显示高剂量组(1.6×10⁷TCID₅₀)诱导的CPV-2 VP及CDV H特异性IgG和中和抗体水平与商品减毒活疫苗组相当(p＞0.05)，低剂量组较低(p＜0.05)。证明CPV–CDV假病毒可诱导双靶点高效体液免疫。

Recombinant CPV-2 pseudovirus expressing CDV H protein elicits T cell activation, accompanied by the serological characteristic of a higher IgG2a/IgG1 ratio（表达CDV H蛋白的重组CPV-2假病毒引发T细胞活化并伴有高IgG2a/IgG1比值特征）：

高剂量免疫组血清IgG2a水平高于或等于IgG1，IgG2a/IgG1比值稳定；IFN-γ、TNF-α及IL-10随免疫时间升高。表明CPV–CDV假病毒有效激活Th细胞及细胞介导免疫应答，呈现Th1偏向型免疫特征。

The sera from recombinant CPV-2 pseudovirus expressing CDV H protein immunized dogs recognize multiple linear B cell epitopes and CD8⁺T Cell immunity associated epitopes of both CPV-2 and CDV（CPV–CDV假病毒免疫犬血清识别CPV-2和CDV多个线性B细胞表位及CD8⁺T细胞相关表位）：

肽扫描显示免疫血清识别CPV-2 VP1/VP2上7条及CDV H上6条线性B细胞表位，其中分别有5条和3条为主要免疫原性表位；脾淋巴细胞再刺激实验显示CPV-2 VP来源的VP2、VP5、VP6、VP9肽段及CDV H来源的H4、H6、H10肽段诱导高水平IFN-γ分泌。证实该假病毒诱导了兼具B细胞与CD8⁺CTL表位识别的广谱免疫应答。

The recombinant CPV-2 pseudovirus expressing CDV H protein immunization protects dogs from the challenge of both CPV-2 and CDV（表达CDV H蛋白的重组CPV-2假病毒免疫保护犬抵抗CPV-2和CDV攻毒）：

攻毒实验中PBS对照组全部死亡，低、中、高剂量CPV–CDV组存活率分别为2/5、4/5、5/5，商品苗组全存活；高剂量组及商品苗组攻毒后粪便病毒载量迅速降至未检出，组织病理无明显病变。证实CPV–CDV重组假病毒可提供与商品减毒活疫苗相当的完全攻毒保护。

讨论部分总结：

本研究首次将自主细小病毒(Autonomous parvoviruses, APVs)成员CPV-2改造为复制缺陷假病毒载体，保留完整ns1及ITR而敲除VP2编码区插入外源基因，VP1/VP2由稳定细胞系反式提供以避免同源重组恢复复制能力，具备较高生物安全性。该系统外源基因容纳量1400–2100 bp，衣壳保留天然构象与血凝活性。以CDV H为模型抗原的二价假病毒在犬体内诱导了Th1偏向的体液与细胞免疫及主要B/T表位识别，攻毒保护效果等同于商用苗。未来可通过进一步优化基因组结构拓展插入容量及筛选更优包装细胞系。此CPV-2重组假病毒平台为多病原联苗开发提供了新策略。

结论（翻译）：

总之，研究人员成功基于CPV-2基因组构建了重组假病毒系统。所制备的表达CDV H蛋白的重组CPV–CDV假病毒在犬体内显示出良好的体液与细胞免疫效果。这些结果表明重组CPV-2假病毒作为候选疫苗具有潜力，并为将其开发为新型疫苗奠定了基础。