血浆蛋白结合的框架：不同小分子方法的比较及新检测方式的适配

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：A framework for plasma protein binding: Comparing methods for diverse small molecules and adapting for novel modalities

　　

Zachary Enlo-Scott|Victor Dudal|Maja Gredelj|Thanusa Shanmugalingam|Florian Klammers|Davide Bassani|Kenichi Umehara|Janneke Keemink

罗氏制药研发中心，罗氏创新中心，F.霍夫曼-罗氏有限公司，瑞士巴塞尔

摘要

准确测定血浆蛋白结合率对于确定药物的治疗窗口以及理解药代动力学/药效学关系至关重要。本研究通过正交实验方法，对26种具有不同理化性质的中小分子药物，检测了三种主要的血浆蛋白结合率测定方法——平衡透析法、超滤法和超速离心法的检测一致性。研究结果显示，这三种方法之间具有很强的相关性（R² = 0.95），其中平衡透析法的结果与文献值高度吻合（R² = 0.97）。

虽然平衡透析法仍是高通量检测的首选方法，但对于那些不符合“5规则”的药物以及高度结合的药物，可通过优化检测方法或采用Transil方法来克服其局限性。对于包含线性肽、环状肽以及降解剂的化合物，研究人员还针对其特点优化了检测方法。对于肽类化合物，将平衡透析的孵育时间从5小时延长至16小时，并加入0.01%的溶质醇以减少非特异性结合现象；同时通过改良后的超速离心法进行正交验证，所得结果可靠性很高（R² > 0.87）。对于降解剂，传统的高通量透析法依然适用，且由于不同物种之间的回收率差异，可有效预测药物的酶促不稳定性，而非非特异性结合问题。本研究还提出了决策树，根据化合物的特性以及稳定性、溶解度等挑战因素，为选择合适的检测方法提供指导，从而确保无论是传统药物还是新型药物，其血浆蛋白结合率都能得到准确测定。

引言

血浆蛋白结合率是依据总药物浓度估算体内游离药物浓度的重要参数。游离药物能够穿过细胞膜，与靶受体发生作用并进而被清除。准确测定血浆蛋白结合率非常重要，因为它会影响药代动力学/药效学关系的评估、治疗窗口的确定，以及潜在的药物相互作用风险的判断，而这些通常都是基于游离药物假说来进行的。^1,2 经过血浆蛋白结合率校正后的体外清除率数据，可通过引入生理因素的模型（如充分混合模型）转化为器官清除率。³ 此外，在临床试验中，还可以利用离体临床样本检测血浆蛋白结合率，以此了解未结合药物在体内的暴露情况如何影响特定人群（如肝肾功能受损者或儿童患者）的药代动力学特征及剂量-反应关系。^4,5 由于儿童患病状况及发育阶段的不同，血浆中的白蛋白和α1-酸性糖蛋白等蛋白水平会发生变化，因此特殊人群的血浆蛋白结合率存在较大差异。⁶ 例如，苯妥英的蛋白结合率相对较高（fu < 10%），且治疗窗口较窄。⁷ 因此，对于患有低白蛋白血症的重症患者，苯妥英的游离比例会增加，进而提升其药理活性及毒性风险，这就更需要对这类患者的药物浓度进行严格监测。所以说，建立可靠的血浆蛋白结合率测定方法，并积累足够的数据以支持从早期发现到后期药物开发各阶段的决策制定，至关重要。在考虑测定结果的准确性和可靠性时，还需注意蛋白结合范围以及对治疗窗口的影响：对于中等程度结合的药物，20%与25%之间的差异微不足道，远低于两倍的水平；而对于高度结合的药物，即便检测值仅相差0.1%与1%，也会导致游离药物浓度上升十倍，进而产生显著的药理效应。尽管血浆蛋白结合率在体内药代动力学和药效学计算中十分重要，但一般并不建议通过结构改造来优化这一参数。⁸ 不过，对于那些效力极强且选择性高的肠促胰素类药物，可以通过设计长脂肪酸链的方式增加其与白蛋白的结合力，利用这种血浆蛋白形成缓释载体，从而有针对性地延长药物在体内的半衰期。^9,10

由于脂溶性、离子化状态和分子大小等理化性质的不同，准确测定血浆蛋白结合率颇具挑战性。目前已有多种测定方法，其中最常用的包括平衡透析法、超滤法和超速离心法。^3,11 平衡透析法和超滤法都是利用具有特定分子量截留值的物理膜将未结合药物分离出来，这类膜的孔径很小，无法让高分子量蛋白质（如大于10-12 kDa的蛋白质）通过。而超速离心法则依靠强大的离心力使血浆蛋白沉淀，之后再采集不含蛋白的层液，即未结合药物所在层。在这三种方法中，平衡透析法的应用最为广泛，因为它具有更高的通量，还包括快速平衡透析法和高通量透析法两种形式。后者 的通量是快速平衡透析法的两倍，而且由于采用了特氟龙材质的平板，表面积较小，非特异性结合现象也相对较少。^12,13

这三种血浆蛋白结合率测定方法各有优缺点，虽然此前已有相关比较研究：¹¹ 但目前直接对比多种测试化合物的公开数据仍然有限，而且关于如何选择合适方法的循证指导也相对缺乏。因此，本研究有两个目标：首先，评估平衡透析法、超滤法和超速离心法在标准化条件下，对26种具有不同理化性质和蛋白结合特征的化合物进行血浆蛋白结合率测定的性能，重点考察其作为筛选工具的适用性；其次，针对30多种具有特殊性质的化合物，在优化条件下测试这三种方法的性能，这些化合物要么属于不符合“5规则”的类型（包括降解剂和肽类），要么是高度结合的药物，常规检测方法往往难以满足其检测需求。此外，还对部分化合物进行了Transil方法的检测。基于这些比较结果，本研究提出了决策树，为选择适合的体外血浆蛋白结合率测定方法提供参考。

章节节选

材料

实验用商业药物及其他化学试剂均购自德国达姆施塔特的默克公司、爱沙尼亚塔林的Cayman公司、英国剑桥的Biorbyt公司或英国泰丁顿的LGC公司。用于测试的化合物则来自F.霍夫曼-罗氏有限公司的化合物库。出于企业保密要求，本研究中所分析的专利化合物的化学身份和分子结构并未公开。血浆则

化合物选择

最初的化合物库包含了26种已上市及在研化合物，这些化合物的未结合比例范围很广（0-100%），其理化性质也各不相同，包括分子量（236-1465）、离子化状态、LogP值（-2.30-8.28）、pH 7.4条件下的LogD值（-0.84-4.10），以及氢键供体数量（0-5）和氢键受体数量（3-28）；具体数据见补充表1。这些化合物既包括符合利平斯基“5规则”的，也包括不符合该规则的。此外，还有部分不符合“5规则”以及高度结合的化合物

讨论

本研究通过检测化学性质多样的化合物，发现高通量透析法、超速离心法和超滤法得到的数据一致性很高，只要满足相应的检测标准，这三种方法基本可以互相替代使用。对于部分化合物，使用不同方法检测得到的结果差异极小（见补充图2）。不过，对于那些未结合比例低于10%的高度结合或不符合“5规则”的化合物，其血浆蛋白结合率的准确测定仍面临诸多挑战

结论

本研究证明，只要根据不同化合物的特性合理调整实验条件，就可以通过平衡透析法、超滤法和超速离心法，为各种化学结构的化合物获得可靠的未结合比例数值。

这项研究强调了针对不符合“5规则”以及高度结合的化合物，需要采用定制化的检测方法。对于线性肽和环状肽而言，本研究的结果表明，虽然膜的扩散速率较低往往会影响常规透析法的检测效果，但通过改良的超速离心法

利益冲突声明

作者均为罗氏公司的员工，声明自己与本研究不存在任何利益冲突。

关于稿件准备过程中生成式AI及AI辅助技术的声明

在撰写本文时，作者使用了Gemini工具来提升文本的可读性和语言表达质量。在使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Isabelle Walter、Barbara Preti、Carina Cantrill、Bjoern Wagner、Michael Reutlinger，以及来自克罗地亚Selvita公司、英国York Bioanalytical Solutions公司和芬兰Admescope公司的合作伙伴们，感谢他们为这项研究做出的宝贵贡献。