《Smart Molecules》：Applications of chitosan derivatives as adjuvants for nanoparticle-based vaccines: A comprehensive review
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开发安全有效的疫苗仍是现代医学的关键优先事项。传统佐剂虽能有效增强免疫反应，但常存在局部反应原性、黏膜免疫诱导能力有限及抗原稳定性差等局限。壳聚糖是一种源自几丁质的天然多糖，其衍生物因具备生物相容性、生物可降解性、黏膜黏附特性及固有免疫刺激活性，已成为纳米颗粒
开发安全有效的疫苗仍是现代医学的关键优先事项。传统佐剂虽能有效增强免疫反应，但常存在局部反应原性、黏膜免疫诱导能力有限及抗原稳定性差等局限。壳聚糖是一种源自几丁质的天然多糖，其衍生物因具备生物相容性、生物可降解性、黏膜黏附特性及固有免疫刺激活性，已成为纳米颗粒疫苗递送领域极具潜力的候选材料。壳聚糖的化学修饰（如三甲基化、季铵化、硫醇化）可显著提升其在生理pH下的溶解度、制剂稳定性及免疫调节功能。壳聚糖衍生物纳米颗粒（chitosan derivative nanoparticles, CDNPs）可实现抗原的高效包封，保护不稳定生物分子，并促进抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）的摄取，能够同时诱导体液免疫与细胞免疫，尤其在黏膜给药途径中表现突出。本综述系统阐述了壳聚糖衍生物的理化性质、免疫增强机制、纳米颗粒制备方法、在临床前与临床疫苗研究中的应用，以及向人用转化面临的挑战。结合近期文献证据，CDNPs有望革新疫苗递送平台，尤其适用于黏膜疫苗与下一代免疫治疗产品。
1 引言
疫苗是预防传染病与防控大流行最有效的策略之一，但其效力往往依赖佐剂来增强免疫原性、稳定抗原并引导恰当的免疫应答。铝盐、油包水乳剂等传统佐剂存在局部炎症、黏膜免疫诱导不足、难以高效递送核酸或蛋白质等敏感生物分子等缺陷。壳聚糖是由甲壳类动物外壳的几丁质脱乙酰化得到的线性多糖，作为天然高分子佐剂与递送载体受到广泛关注。其生物可降解性、低毒性及固有阳离子特性使其可与带负电的生物分子和细胞膜相互作用，同时具备优异的黏膜黏附性能，非常适用于对抗经呼吸道或胃肠道入侵病原体的黏膜疫苗递送。通过化学修饰（如N-三甲基壳聚糖（N-trimethyl chitosan, TMC）、硫醇化壳聚糖、羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan, CMC））可进一步提升壳聚糖在生理pH下的溶解度与免疫刺激活性，其纳米颗粒（CDNPs）能保护不稳定抗原、促进树突状细胞与巨噬细胞摄取并实现控释。本综述旨在系统比较不同壳聚糖衍生物的理化性质、免疫学表现及转化潜力。
2 壳聚糖衍生物：性质与修饰
2.1 壳聚糖衍生物的结构基础
壳聚糖由β-(1→4)连接的D-葡糖胺与N-乙酰-D-葡糖胺单元组成，酸性条件下带正电的特性使其可与带负电的抗原、核酸及细胞膜相互作用。但在中性及碱性水相环境中溶解度极低，因此需开发水溶性衍生物以满足疫苗递送需求。壳聚糖的C2位伯氨基、C3与C6位羟基是主要化学修饰位点，结构衍生化会显著改变其理化与生物学性质：例如TMC的氨基季铵化引入永久正电荷，提升生理pH下的溶解度、上皮细胞通透性及与细胞膜的相互作用，进而增强黏膜黏附与细胞摄取；硫醇化引入巯基，可通过二硫键与黏蛋白糖蛋白结合，大幅延长黏膜表面滞留时间；羧甲基化引入羧基，在提升水溶性与生物相容性的同时降低整体电荷密度，影响抗原结合与释放行为。这些结构修饰直接决定粒径、ζ电位、包封效率及免疫激活能力等核心性能参数，是理性设计CDNP的基础。
2.2 常用衍生物
为克服天然壳聚糖的局限，多种衍生物被开发用于疫苗递送：TMC因中性pH下溶解度高，可增强黏膜黏附并促进大分子跨上皮屏障的旁细胞转运；季铵化壳聚糖携带永久正电荷，不仅提升抗原结合能力，还增强制剂在生理条件下的稳定性；硫醇化壳聚糖可通过二硫键与黏膜表面结合，延长滞留时间并实现抗原控释；CMC则兼具高水溶性、优异生物相容性及固有免疫刺激活性，是多功能纳米疫苗递送候选材料。
2.3 相较于传统佐剂的优势
壳聚糖衍生物具备多项传统佐剂无法比拟的优势：固有生物可降解性与低毒性保障临床应用安全性；结构灵活，可包封蛋白质、多肽、DNA、RNA等多种抗原，保护不稳定生物分子免受降解；黏膜黏附特性提升黏膜表面滞留时间，促进抗原摄取与局部免疫激活；可同时诱导体液免疫与细胞免疫，包括产生黏膜分泌型IgA（secretory IgA, sIgA），这对阻断病原体黏膜入侵至关重要。
2.4 主要壳聚糖衍生物的比较评价
不同壳聚糖衍生物的性能差异显著：TMC粒径150–300 nm，ζ电位+25至+45 mV，包封效率70%–90%，优势为高生理溶解度、强黏膜黏附与上皮通透性，局限是高季铵化程度可能存在电荷依赖性细胞毒性，最适用于鼻内、口服等黏膜疫苗及蛋白质/多肽递送；硫醇化壳聚糖粒径180–350 nm，ζ电位+20至+35 mV，包封效率65%–85%，优势为二硫键介导的超强黏膜黏附、滞留时间延长及核酸转染效率提升2–3倍，局限是巯基易氧化导致储存稳定性不足，适用于DNA/RNA疫苗与黏膜递送；CMC粒径200–400 nm，ζ电位?10至+20 mV，包封效率50%–70%，优势为高水溶性、优异生物相容性与缓释特性，局限是正电荷较低导致细胞摄取效率下降，适用于缓释系统与蛋白质递送；季铵化壳聚糖粒径150–280 nm，ζ电位+30至+50 mV，包封效率75%–90%，优势为强静电作用、高制剂稳定性与细胞摄取效率，局限是高电荷密度可能引发非特异性相互作用与细胞毒性，适用于亚单位疫苗与抗原递送系统；天然壳聚糖粒径200–500 nm，ζ电位+15至+30 mV，包封效率40%–70%，优势为生物可降解、低毒与固有佐剂活性，局限是中性pH溶解度差、通透性差，多用于常规与实验性配方。总体而言，TMC最适合黏膜与上皮转运，硫醇化壳聚糖适合黏膜黏附与核酸递送，CMC适合高生物相容性缓释系统，但仍缺乏标准化的头对头比较研究。
2.5 壳聚糖衍生物与传统佐剂的优势对比
相较于铝盐、油包水乳剂等传统佐剂，壳聚糖衍生物的核心优势包括：属于高分子纳米递送佐剂系统，可生物降解且生物相容性优异，而铝盐不可降解，油包水乳剂虽用可降解油但易局部残留；可高效包封蛋白质、多肽、DNA、RNA，而传统佐剂仅能吸附蛋白质或分散抗原；可保护抗原免受酶解，传统佐剂保护能力极弱或仅为中等；可同时诱导体液与细胞免疫，传统佐剂多为Th2偏向的体液免疫；可强力诱导包括sIgA在内的黏膜免疫，传统佐剂几乎无此能力；通过静电作用增强细胞摄取，传统佐剂摄取效率低；佐剂机制涵盖模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）激活、APC摄取增强与控释，传统佐剂仅依赖储库效应与炎症小体激活；表面电荷可调（+20至+50 mV），传统佐剂多为中性或微负电；粒径100–400 nm且可调控，传统佐剂多为微米级聚集体；可实现可调控的缓释动力学，传统佐剂缓释能力有限；高度适配核酸疫苗，传统佐剂完全不适用；具备强黏膜黏附性，传统佐剂无此特性；安全性风险主要为高电荷密度下的潜在细胞毒性，传统佐剂易引发局部炎症、肉芽肿与注射部位反应；可通过化学修饰实现高度可调控的配方设计，传统佐剂灵活性极低。目前其临床状态为新兴研究阶段，而铝盐已广泛使用，油包水乳剂仅在部分疫苗中获批。
3 壳聚糖衍生物的免疫增强机制
3.1 与抗原呈递细胞的相互作用
CDNPs的阳离子表面电荷可与APC（尤其是树突状细胞与巨噬细胞）的带负电细胞膜发生强静电作用，通过内吞途径增强细胞黏附与内化。摄取后，包封抗原在内体或溶酶体腔室释放并被加工，随后呈递于主要组织相容性复合体I类与II类分子，激活CD4+辅助T细胞与CD8+细胞毒性T淋巴细胞，衔接先天免疫与适应性免疫。同时CDNP递送可保护抗原免于过早降解，保障胞内运输效率与持续抗原供应。
3.2 细胞因子谱调控
除促进抗原摄取外，壳聚糖衍生物可主动调控细胞因子微环境，塑造免疫应答的质量与强度。CDNPs可刺激Th1型细胞免疫与Th2型体液免疫相关的广谱细胞因子分泌，实现平衡免疫应答。例如TMC纳米颗粒可促进IL-2、IFN-γ等促炎细胞因子（支持细胞毒性T细胞活化）与IL-4、IL-10等Th2相关细胞因子（促进抗体生成）的分泌，这对本身免疫放大能力弱的亚单位与核酸疫苗尤为重要。
3.3 黏膜免疫诱导
壳聚糖衍生物最突出的优势之一是可诱导强效黏膜免疫。CDNPs的固有黏膜黏附性可延长其在鼻腔、口腔、肠上皮等黏膜表面的滞留时间，提升抗原摄取概率；同时可协助抗原跨上皮屏障转运，促进派氏集合淋巴结与鼻相关淋巴组织中的微褶皱（microfold, M）细胞摄取，刺激局部与全身免疫应答，产生sIgA抗体，直接在病原体入侵的呼吸道与胃肠道门户发挥中和作用，因此CDNP疫苗对黏膜病原体防护极具潜力。
3.4 佐剂与免疫刺激效应
除作为抗原载体外，壳聚糖衍生物本身具备固有佐剂活性。CDNPs可通过与APC表达的Toll样受体等PRR相互作用激活先天免疫通路，启动下游信号级联，促进树突状细胞成熟、共刺激分子上调及炎性介质分泌，为适应性免疫（包括效应与记忆B/T细胞分化）提供关键启动信号，实现抗原递送与免疫增强的双重功能。
4 CDNPs的制备技术
制备方法直接决定CDNPs的理化性质、稳定性、抗原载量与免疫学性能，主流技术包括离子凝胶法、乳化交联法、聚电解质复合法与干燥稳定化技术。
离子凝胶法是最常用的经典方法，基于带正电的壳聚糖衍生物与三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, TPP）等多价聚阴离子之间的静电作用，在温和水性条件下自发交联形成纳米颗粒，无需有机溶剂与高温，可保护蛋白质、多肽、核酸等不稳定抗原的结构与生物活性，且粒径、表面电荷可通过聚合物浓度、pH、壳聚糖/TPP比例、搅拌速度精准调控，工艺简单、重现性好、易放大，广泛应用于蛋白质与DNA疫苗开发。
乳化交联法通过高速均质或超声形成油包水或水包油乳液，再用戊二醛等交联剂化学交联，得到机械稳定性高、粒径分布窄的纳米颗粒，适合需要高结构刚性与长效释放的场景，但有机溶剂与交联剂的残留可能损害抗原稳定性或带来毒性风险，需复杂的纯化步骤，因此仅适用于耐受严苛工艺的抗原。
聚电解质复合法是基于静电作用的无溶剂温和技术，带正电的壳聚糖衍生物可直接与带负电的抗原（DNA、RNA、阴离子蛋白）在水相中自发形成纳米颗粒，无需交联剂与有机溶剂，特别适合核酸疫苗递送，可高效复合核酸、保护其免受酶解并增强细胞摄取，同时保留敏感抗原的生物活性，还可便捷修饰表面特性以增强靶向或免疫刺激效果，是下一代疫苗平台的优选技术。
喷雾干燥与冷冻干燥是关键的制剂稳定化后处理技术，可将纳米颗粒混悬液转化为干粉，大幅提升货架期，便于储存、运输与给药。冷冻干燥在低温下进行，配合冻保护剂可最大程度维持抗原完整性与纳米颗粒结构，减少聚集与生物活性损失；喷雾干燥可实现快速规模化生产适合口服与鼻用疫苗的干粉，但需优化工艺以避免热致抗原降解。二者均在保留免疫原性的同时提升制剂稳定性，拓展了CDNP疫苗用于黏膜免疫与全球分发的可行性。
5 临床前疫苗研究应用
CDNPs已在多种临床前模型中验证其多功能性，可包封多样抗原、保护其稳定并调控免疫应答，在蛋白质、核酸、黏膜与癌症疫苗中均取得积极结果，可诱导强效全身与黏膜免疫且安全性良好。
在蛋白质与多肽疫苗中，TMC与季铵化壳聚糖表现突出：负载流感血凝素抗原的TMC纳米颗粒经鼻给药后，可在小鼠模型中诱导高水平血清IgG与黏膜sIgA，这归因于TMC的高溶解度、黏膜黏附与上皮渗透特性；季铵化壳聚糖负载乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）可显著提升抗体滴度，同时激活细胞毒性T淋巴细胞应答，证明其兼具载体与佐剂的双重功能。
在DNA与RNA疫苗中，CDNPs解决了核酸不稳定与细胞摄取差的瓶颈：壳聚糖衍生物的阳离子特性可与带负电的核酸形成强静电复合物，提升稳定性与转染效率。硫醇化壳聚糖纳米颗粒包封质粒DNA后，可在动物模型中增强基因表达、诱导强抗原特异性IgG与T细胞应答，其增效源于细胞摄取增加、胞内滞留延长与抗原表达可控，非常适合下一代mRNA与DNA疫苗平台。
在黏膜疫苗中，CDNPs充分发挥其黏膜黏附与上皮渗透优势：鼻内给药的CDNP流感疫苗与SARS-CoV-2疫苗可在鼻腔分泌物中诱导高水平sIgA，同时激发全身免疫，实现双层防护；口服CDNP疫苗可保护抗原免受胃肠道恶劣环境破坏，促进派氏集合淋巴结M细胞摄取，激活肠道相关淋巴组织，诱导肠道黏膜sIgA与全身抗体应答，是肠道病原体疫苗的理想候选。
在免疫治疗与癌症疫苗中，CDNPs可递送肿瘤相关抗原，增强抗原呈递并激活肿瘤特异性T细胞应答，在小鼠模型中显著抑制肿瘤生长甚至实现消退；联合递送肿瘤抗原与细胞因子、TLR激动剂等免疫调节剂可进一步放大抗肿瘤效应，通过同步促进抗原呈递与先天免疫激活获得更强更持久的应答，是个性化癌症疫苗的重要平台。
6 临床研究与应用转化潜力
尽管多数研究仍处于临床前阶段，早期临床试验已证实CDNPs的转化前景。流感TMC纳米颗粒疫苗在人体试验中耐受性良好，无严重不良反应，且可诱导鼻腔分泌物sIgA升高与可检测的全身抗体应答，证明壳聚糖衍生物可有效突破传统肌注疫苗难以诱导黏膜免疫的局限。乙型肝炎CDNP疫苗的早期临床研究显示，其抗原特异性抗体应答优于传统铝佐剂疫苗，且可实现剂量节约——更低抗原量即可达到相当或更优的免疫原性，这对大规模免疫规划可降低疫苗成本、提升全球可及性。针对COVID-19等新发传染病，壳聚糖纳米平台作为mRNA疫苗递送载体的早期临床研究正在开展，初步结果显示其可提升mRNA稳定性、增强细胞摄取并调控免疫应答，且安全性可接受，凸显了其在新发病原体快速响应疫苗中的适配性。综上，CDNPs是有望衔接实验性配方与临床产品的多功能平台，需持续推进临床评估、规模化制造与监管标准化以实现广泛应用。
7 挑战与未来展望
当前研究的核心局限是缺乏相同实验条件下不同壳聚糖衍生物的头对头比较，多数研究的配方、抗原类型与评价模型各异，难以直接横向对比，阻碍了最优衍生物的筛选，亟需系统化的平行研究。
稳定性与可放大性是首要挑战：纳米颗粒聚集、粒径分布变化、表面电荷丢失会损害抗原载量、释放动力学与免疫原性，抗原在制备与储存中的降解风险（尤其对蛋白质与核酸）也不容忽视。需优化冷冻干燥与喷雾干燥工艺，选用合适的冻保护剂与稳定剂以维持颗粒完整性与抗原活性；同时需建立可重现的规模化生产工艺，保障批次间一致性，连续制造与过程分析技术的应用有望解决放大难题。
监管考量构成另一关键障碍：壳聚糖衍生物属于新型佐剂与递送系统，监管机构要求其纳米制剂需完成粒径、表面电荷、形态、包封率、释放曲线等全面表征，但目前缺乏统一的纳米疫苗表征标准，且大规模生产的持续质量控制要求极高，针对纳米技术的专门监管指南仍在完善中，早期与监管机构沟通并建立统一的检测框架可加速审批进程。
免疫原性与安全性仍需谨慎评估：尽管壳聚糖衍生物总体安全，但过度免疫刺激或非预期的系统炎症反应仍可能带来风险，高阳离子电荷若未受控也可能引发非特异性免疫激活。需开展全面的剂量优化研究以平衡免疫效力与安全性，长期重复给药、生物分布与潜在蓄积的评估对儿科人群与加强免疫程序尤为重要。
未来发展方向包括：联合递送策略，将壳聚糖衍生物与TLR激动剂等免疫刺激分子共递送，实现协同免疫激活；靶向递送系统，通过在CDNP表面偶联树突状细胞、巨噬细胞或黏膜上皮细胞特异性配体，提升抗原定位精度、减少脱靶效应；适配下一代疫苗技术，为mRNA、DNA、重组亚单位等新发与再发传染病疫苗提供递送平台。其安全性、黏膜免疫能力与配方灵活性使其成为快速响应疫苗的理想选择，需融合免疫学、材料科学与药剂学的跨学科研究以充分释放其潜力。
8 结论
壳聚糖衍生物已成为极具前景的纳米疫苗递送平台，兼具抗原保护、黏膜黏附与固有免疫刺激活性的独特优势。其阳离子特性与结构可调控性可高效包封蛋白质、多肽、核酸等多样抗原，促进APC摄取并延长黏膜表面滞留，共同诱导涵盖全身体液与细胞免疫、以及黏膜免疫的平衡强效应答，这对防御经上皮入侵的病原体至关重要。大量临床前研究与新兴临床证据显示，CDNP疫苗可在良好安全性（源于生物可降解性与低毒性）的基础上显著提升免疫原性，且适配鼻内、口服等多样给药途径，是下一代疫苗佐剂与递送系统的有力候选。然而，制剂稳定性、规模化制造与监管标准化仍是临床转化的核心障碍，需通过先进制剂策略、规模化制造技术与统一监管框架加以解决。随着跨学科研究的深入与理性设计的推进，CDNP疫苗平台有望变革疫苗研发格局，尤其在黏膜免疫、新发传染病与核酸免疫疗法领域发挥关键作用。
