出生后期肌腱特异性删除Piezo1改变小鼠跟腱胶原原纤维（collagen fibril）架构

《Matrix Biology Plus》：Postnatal Piezo1 deletion alters collagen fibril architecture in mouse Achilles tendon

　　

摘要：肌腱是传递肌骨间机械力、维持关节稳定的重要结缔组织，正常的机械感受（mechanosensation）对保持其细胞外基质（extracellular matrix, ECM）完整性至关重要。机械敏感性离子通道PIEZO1被认为可在高机械负荷下调节肌腱架构，但其在基础生理条件下的作用尚不清楚。本研究利用他莫昔芬诱导的Scx-CreERT2系统构建肌腱靶向Piezo1条件性敲除（Piezo1p-t-ko）小鼠，所有体内实验均使用雌性小鼠。PIEZO1缺失导致透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）下跟腱厚度显著减小、胶原原纤维直径变小。RNA测序及qPCR分析显示关键ECM相关基因Col1a1、Dcn、Fmod及肌腱转录因子Mkx下调，免疫荧光也证实MKX、COL1A1和DCN信号减弱。邻近肌肉形态及转录组未发生改变，支持表型的肌腱选择性。结果表明，在基础生理条件下，PIEZO1参与雌性小鼠跟腱胶原原纤维架构及肌腱相关转录程序的维持。

论文解读：出生后期肌腱特异性删除Piezo1改变小鼠跟腱胶原原纤维架构

本文原载于《Matrix Biology Plus》。

研究背景与立项依据

肌腱作为致密的胶原富含结缔组织，将肌肉收缩力传递至骨骼以完成关节运动并维持骨骼排列，其层级化结构依赖持续的正常机械感受来感知并适应外部力学负荷，以维持ECM合成与胶原有序组装。机械敏感性阳离子通道PIEZO1可将机械刺激转化为细胞内Ca²⁺信号，此前研究表明PIEZO1激活可促进Tenocyte（腱细胞）内钙内流及包括Mkx（Mohawk）、Scx（Scleraxis）在内的Tenogenic transcriptional program（腱源性转录程序），进而促进ECM合成及胶原原纤维成熟；过表达Piezo1可使跟腱增粗、胶原原纤维直径增大、提升弹性储能及运动表现。然而既往研究多关注增强Piezo1信号或外加机械刺激下的适应性变化，内源性Piezo1在正常基础生理负荷下对成年后肌腱ECM完整性及胶原原纤维架构的维持作用尚未明确。为此，研究人员构建出生后诱导的肌腱特异性Piezo1条件性敲除小鼠，以探究基础状态下Piezo1对负重跟腱结构与转录特征的影响。

主要关键技术方法

研究人员使用Scx-CreERT2;Piezo1^flox/flox交配获得后代，于6周龄雌鼠腹腔注射他莫昔芬5天诱导Cre重组，以Scx-CreERT2阳性且Piezo1^+/+同窝雌鼠为对照，18周龄取材。关键技术包括：基因组DNA PCR验证肌腱组织特异性重组；大体形态测量跟腱宽度；透射电镜（TEM）横切面拍摄并盲法测量胶原原纤维短轴直径及计算原纤维密度；跟腱组织Bulk RNA-seq及Matrisome（基质组）重分析、GO富集；qPCR验证差异基因；冰冻切片免疫荧光染色检测PIEZO1、MKX、COL1A1、DCN蛋白信号并定量；邻近腓肠肌重量及转录组比对排除肌肉受累；采用非配对双尾Student's t检验进行统计学分析。

研究结果

Generation of tendon-specific Piezo1 knockout mice（肌腱特异性Piezo1敲除小鼠的构建）

通过Scx-CreERT2与Piezo1^flox/flox杂交并在6周龄他莫昔芬诱导，获得肌腱特异性Piezo1^p-t-ko雌鼠。基因组PCR证实重组只发生于肌腱而非相邻肌肉，免疫荧光见跟腱PIEZO1信号降低。两组18周龄体长与体重无差异，证明敲除不影响全身生长。

Postnatal Piezo1 deletion is associated with reduced tendon thickness and altered collagen ultrastructure（出生后Piezo1缺失伴随肌腱变薄及胶原超微结构改变）

大体观察及定量显示Piezo1^p-t-ko雌鼠跟腱宽度显著小于对照。TEM显示胶原原纤维直径分布左移，平均直径由对照134.3±6.4 nm降至118.6±12.8 nm（p=0.023），中位数由140 nm降至115 nm，小直径原纤维比例增加，大直径原纤维四分位数基本保留；原纤维密度有升高趋势但无统计学意义。表明出生后Piezo1缺失引起跟腱变薄、胶原原纤维偏向细小化及原纤维排布改变。

Transcriptomic and qPCR analyses reveal altered tendon-associated and ECM-related gene expression（转录组与qPCR揭示肌腱相关及ECM基因表达改变）

RNA-seq火山图与热图显示Col1a1、Dcn、Fmod及Mkx在Piezo1^p-t-ko跟腱中显著下调。GO分析示下调基因富集于骨骼系统发育及ECM组织条目。Matrisome分析同样见Col1a1、Dcn、Fmod、Comp、Col3a1下调。qPCR验证Piezo1、Mkx、Dcn、Fmod、Col1a1相对表达量较对照显著降低。GSEA见上调条目含actin细胞骨架、Ca²⁺转运及线粒体氧化磷酸化通路，部分Calcineurin/NFAT与YAP/TAZ相关基因表达上调，提示为继发代偿反应。相邻骨骼肌重量与转录谱无差异，佐证表型肌腱特异性。

Postnatal Piezo1 deletion is associated with altered selected tenocyte and ECM protein signals（出生后Piezo1缺失伴随选定腱细胞及ECM蛋白信号改变）

免疫荧光显示Piezo1^p-t-ko跟腱中段MKX阳性细胞核比例显著减少，COL1A1与DCN荧光强度呈降低趋势，其中DCN达显著差异。结果与mRNA水平下调一致，说明Piezo1缺失伴随腱细胞MKX表达及ECM蛋白沉积减少。

讨论与结论翻译

本研究证明在基础生理条件下，PIEZO1信号参与出生后雌性小鼠跟腱结构与转录特征的维持。利用他莫昔芬诱导Scx-CreERT2驱动系统构建肌腱特异性Piezo1敲除小鼠，Piezo1缺失导致跟腱肉眼变薄、胶原原纤维直径减小，以及腱源性转录因子与ECM基因协同下调。这些发现提示，在基础笼养活动状态下，Piezo1缺失与胶原原纤维架构及肌腱相关转录程序改变相关。此前Passini等人使用新生期诱导的同类模型发现Piezo1缺失削弱牵张诱导Ca²⁺响应及尾腱束刚度，而本工作采用6周龄诱导并于18周龄分析负重跟腱，补充了不同肌腱类型与诱导时机下胶原原纤维架构、原纤维密度、肌腱宽度及转录变化的信息。本研究发现与先前本课题组过表达Piezo1所致反向变化相互印证，提示PIEZO1依解剖部位与受力环境可在不同基质层级介导肌腱适应。由于未行生物力学测试与胶原交联分析，所观察到的原纤维表型应主要理解为基质维持受损的结构证据，而非直接证明力学性能改变。局限性包括未做力学与运动测试、单一时间点、仅雌性小鼠、未直接测通道活性与ECM组分周转等。综上，结果表明PIEZO1参与出生后成熟期及维持阶段雌性小鼠跟腱肌腱相关基因表达与胶原原纤维架构的调控，为今后在不同发育阶段、负荷条件及系统环境下探讨PIEZO1影响肌腱结构提供了基础，也为靶向Piezo1或其下游网络防治肌腱病变及支持肌骨健康老化指明方向。