基于代谢分析指导的工程化改造实现 Picosynechococcus sp. PCC 7002 光合生产谷氨酰胺

《Metabolic Engineering Communications》：Photosynthetic production of glutamine through metabolic analysis-based engineering of Picosynechococcus sp. PCC 7002

　　

谷氨酰胺是核苷酸以及若干其他氨基酸生物合成过程中重要的氮供体。增殖中的细胞会消耗大量谷氨酰胺，且细胞培养基中谷氨酰胺通常是含量最高的氨基酸。谷氨酰胺目前通过细菌发酵进行工业化生产，但该过程需要外源补加糖类作为碳源。本研究以蓝细菌 Picosynechococcus sp. PCC 7002 为底盘，旨在建立一种仅以 CO₂ 为碳源的谷氨酰胺光合生产方法。通过导入来自 Corynebacterium glutamicum 的谷氨酸脱氢酶（GDH）和来自 Saccharomyces cerevisiae 的谷氨酰胺合成酶（GS），胞外释放的谷氨酰胺浓度得到提高。代谢组学（metabolome）分析显示，谷氨酰胺生产细胞内柠檬酸水平下降。为增强柠檬酸补充，研究人员考察了包括 l-乳酸同化和糖原缺陷在内的代谢工程策略。进一步导入来自 C. glutamicum 的丙酮酸羧化酶（PYC）和柠檬酸合成酶（CS）后，谷氨酰胺产量显著提高。在优化光照强度和 CO₂ 浓度后，重组菌株可生产 1,168.5 μM（170.76 mg·L^-1）谷氨酰胺。本研究建立了将 CO₂ 转化为谷氨酰胺的代谢工程策略，并表明蓝细菌是具有应用前景的谷氨酰胺光合生产宿主。

该论文发表于《Metabolic Engineering Communications》，围绕蓝细菌光合合成谷氨酰胺这一目标，系统建立了“代谢分析发现瓶颈—定向工程强化通路—培养条件优化提升产量”的研究路径。研究背景在于，谷氨酰胺既是嘌呤、嘧啶及多种氨基酸生物合成的重要氮源和碳源，也是动物细胞培养体系中的关键营养组分。随着生物制药和培养肉等产业发展，谷氨酰胺需求预计持续增加。现有工业生产主要依赖细菌发酵，通常需要外加糖作为碳源，因此仍受制于有机原料投入。相比之下，蓝细菌能够通过产氧光合作用直接固定 CO₂，具有构建低成本、可持续氨基酸生产体系的潜力。然而，蓝细菌用于谷氨酰胺生产的研究仍较少，尤其缺乏针对关键代谢瓶颈的系统工程设计，因此开展本研究具有明显的方法学与应用价值。

为实现这一目标，研究人员选用生长较快、遗传操作基础较成熟的海洋蓝细菌 Picosynechococcus sp. PCC 7002 作为宿主。首先，研究人员考察了该菌对胞外谷氨酰胺的利用倾向，发现其对谷氨酸的消耗显著，而对谷氨酰胺的吸收较弱，提示该菌更适合作为谷氨酰胺分泌型生产底盘。随后，研究人员导入来自 Corynebacterium glutamicum 的谷氨酸脱氢酶（GDH，催化 2-氧戊二酸与氨生成谷氨酸）以及来自 Saccharomyces cerevisiae 的谷氨酰胺合成酶（GS，催化谷氨酸生成谷氨酰胺），构建出能够分泌谷氨酰胺的工程菌株 KC0111。在此基础上，结合细胞内代谢物谱分析，研究人员发现柠檬酸显著下降，进而判断三羧酸（TCA）循环入口的碳补充可能构成限制步骤。围绕这一瓶颈，研究进一步测试了 l-乳酸同化、糖原合成缺陷、mdh 缺失、丙酮酸羧化酶（PYC）导入以及柠檬酸合成酶（CS）导入等策略，最终获得谷氨酰胺产量显著提高的菌株 KC0157，并通过培养基、光强和 CO₂ 浓度优化将产量提升至 1,168.5 μM（170.76 mg·L^-1）。论文的重要意义在于首次概念验证了蓝细菌可直接以 CO₂ 为唯一碳源进行谷氨酰胺光合生产，同时指出强化 TCA 循环入口是提升该产物合成的关键工程方向。

研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类：其一，基于同源重组的蓝细菌遗传工程，对 PCC 7002 进行外源基因导入和内源基因缺失，构建多株代谢工程菌；其二，采用毛细管电泳飞行时间质谱（CE-TOF MS）进行胞外与胞内代谢组学分析，以比较不同菌株的代谢物变化并定位限速步骤；其三，通过光自养培养体系对不同工程菌株进行表型评价，监测生长、谷氨酰胺与谷氨酸分泌；其四，针对高产菌株进一步优化培养条件，包括培养基组成、光照强度和 CO₂ 补给浓度。本文未涉及样本队列研究，全部实验对象均为构建的蓝细菌菌株。

在研究结果部分，论文首先在“3.1. Development of glutamine-producing cyanobacteria”中说明了谷氨酰胺生产菌株的建立过程及初步效果。研究人员先验证 PCC 7002 对胞外谷氨酰胺吸收较低，这为产物积累和分泌提供了基础。之后导入 CgGDH 与 ScGLN1，得到 KC0111。结果显示，该菌株在光自养条件下生长与野生型接近，但培养上清中的谷氨酰胺浓度显著升高，说明通过增强 2-氧戊二酸到谷氨酸、再到谷氨酰胺的合成能力，可以在不明显损害生长的情况下实现谷氨酰胺分泌。谷氨酸虽也被检测到，但其胞外浓度变化不大，表明导入的关键效应主要体现在谷氨酰胺积累上。

在“3.2. Metabolic analysis for improving glutamine production”中，研究人员通过代谢组学解析进一步寻找限制步骤。KC0111 中胞内谷氨酰胺和谷氨酸均高于野生型，说明导入的 CgGDH 与 ScGLN1 确实增强了从 2-氧戊二酸向谷氨酰胺合成的通量。然而，KC0111 中胞内柠檬酸水平较野生型下降 22.5 倍，而丙酮酸与乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）并未同步下降，这一结果提示问题并不在上游底物匮乏，而更可能位于柠檬酸生成环节本身。基于该分析，研究人员提出“柠檬酸补充不足是谷氨酰胺生产瓶颈”的判断，并据此设计后续工程策略。这一部分的核心贡献在于通过代谢证据而非经验推断确定了干预靶点。

在“3.3. Improvement of glutamine production through citrate replenishment”中，论文系统比较了多种增强柠檬酸补充的手段。首先，研究人员尝试利用既往报道的 l-乳酸同化模块 EcLldD/EcLldP，构建 KC0112，希望通过外源碳流分配提升细胞内柠檬酸水平；同时，也构建了糖原合成缺陷菌株 KC0136，以促进固定碳更多流向 TCA 循环。结果显示，KC0112 的谷氨酰胺产量仅较 KC0111 轻度增加，而 KC0136 的产量反而下降，说明这两种间接强化策略对本研究体系并未产生显著增益。随后，研究转向直接改造 TCA 循环入口。单独缺失 mdh 的 KC0155 与 KC0111 表现接近，提示阻断草酰乙酸向苹果酸转化并不足以提升产量。在此基础上导入来自 C. glutamicum 的突变型丙酮酸羧化酶 CgPYC^P458S，得到 KC0156，产量仍未明显改善，说明仅增加草酰乙酸补充仍不足以解除限制。进一步同时导入 CgCS 后形成 KC0157，谷氨酰胺产量大幅提升，14 d 时达到 572.39 μM，是 KC0111 的 8.88 倍。代谢组学结果进一步显示，KC0157 的胞内柠檬酸与谷氨酰胺水平均高于 KC0111，乙酰辅酶 A 水平则明显降低，支持外源 CS 提高了乙酰辅酶 A 与草酰乙酸缩合生成柠檬酸的能力。该部分明确证明，强化 TCA 循环入口尤其是柠檬酸合成步骤，是提高蓝细菌谷氨酰胺产量的关键。

在“3.4. Optimization of culture conditions for glutamine production”中，研究人员进一步对高产菌株 KC0157 的培养条件进行优化。采用富含硝酸盐和磷酸盐的 MAD2 培养基后，细胞在高光条件下生长改善；同时，将光强由 100 μmol photons·m^-2·s^-1 提高至 500 μmol photons·m^-2·s^-1 可进一步促进生物量积累与谷氨酰胺生成。CO₂ 由 2% 提高到 5% 虽有助于生长，但未继续提高谷氨酰胺产量。最终，在 MAD2 培养基、高光和 2% CO₂ 条件下，KC0157 于 14 d 达到最高谷氨酰胺浓度 1,168.5 μM（170.76 mg·L^-1）。这一结果说明，除遗传改造外，光照与营养条件也是影响光合化学品积累的重要因素，且最优生长条件与最优产物积累条件并不完全一致。

在讨论部分，论文首先强调，本研究成功证明蓝细菌能够仅以 CO₂ 为碳源合成并分泌谷氨酰胺。研究人员选择 CgGDH 和 ScGLN1，依据是前者已被证明有利于谷氨酸衍生物生产，后者在多种 GS 中表现出较高活性，且较不易受到蓝细菌中 GS 失活因子 GifA/GifB 的抑制。论文同时指出，工程菌株为何能够将谷氨酰胺释放到胞外仍不清楚，尽管文中讨论了机械敏感通道（MSC，mechanosensitive channel）可能参与氨基酸外排，但该机制尚未在本研究中直接验证。其次，讨论部分回到 TCA 循环碳流问题，认为代谢组学揭示的柠檬酸下降准确指向了瓶颈所在，而实验结果也证明，相比间接增强碳流，直接增强柠檬酸生成更有效。这一结论与既往关于蓝细菌 TCA 循环通量偏低、CS 活性可能有限的认识相一致。最后，研究人员也客观指出，尽管 KC0157 的谷氨酰胺产量远低于发酵法的 Corynebacterium glutamicum，尚不足以满足实际应用，但作为蓝细菌体系中的首次概念验证，该研究证明了未来直接利用 CO₂ 进行谷氨酰胺生产的可能性。论文还提出，从长期应用角度看，若结合能够直接利用 N₂ 的固氮蓝细菌，以及蓝细菌对动物细胞培养废物如乳酸和铵的处理潜力，则有望支撑更可持续的循环式细胞培养系统。

研究结论可概括为：研究人员通过在 Picosynechococcus sp. PCC 7002 中导入 CgGDH 与 ScGLN1，成功构建了能够通过光合作用分泌谷氨酰胺的工程蓝细菌；代谢组学分析表明，柠檬酸补充不足是限制谷氨酰胺生产的关键瓶颈；进一步通过增强 TCA 循环入口，尤其是导入 CgPYC^P458S 与 CgCS，显著提高了谷氨酰胺产量；在优化培养条件后，工程菌株可达到 1,168.5 μM（170.76 mg·L^-1）的谷氨酰胺产量。总体而言，该研究建立了将 CO₂ 转化为谷氨酰胺的蓝细菌代谢工程策略，并证明蓝细菌是具有潜力的谷氨酰胺光合生产平台。