基于废水的意大利特伦托省城乡地区抗菌药物耐药性与细菌群落评估

《MicrobiologyOpen》：Wastewater-Based Assessment of Antimicrobial Resistance and Bacterial Communities in Urban and Rural Areas in the Province of Trento (Italy)

　　

基于废水的流行病学（WBE）可作为临床监测的补充，用于评估抗菌药物耐药性（AMR）在人群中的传播。研究人员分析了意大利特伦托省七家污水处理厂的 sewage 样本，采用培养法和宏基因组DNA方法相结合，以调查城乡地区抗菌药物耐药细菌（ARBs）和耐药基因的流行情况。超广谱β-内酰胺酶产生型大肠杆菌（ESBL-Ec）的流行率在城市地区高于农村地区。经定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）检测，无论样本来源区域如何，intI1以及与广泛传播耐药性相关的基因均较为丰富，包括四环素耐药基因（tetA）、磺胺类耐药基因（sul1）和氟喹诺酮类耐药基因（qnrS）。在临床相关耐药基因中，仅大环内酯类耐药基因（ermB）丰度较高，而第三代头孢菌素耐药基因（blaCTX-M）、碳青霉烯类耐药基因（blaKPC）、万古霉素耐药基因（vanA）和甲氧西林耐药基因（mecA）的检测浓度则低得多。此外，ermB、blaKPC和vanA的丰度在城市地区显著更高。16S rRNA扩增子测序显示了复杂的细菌群落组成，并发现不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链球菌属（Streptococcus）等可能包含世界卫生组织（WHO）细菌优先病原体清单中报告的ARBs的属丰度较高，其中链球菌属在城市地区显示出更高的流行率。综上所述，本研究数据强调了在不同特征（如 vocation、市镇数量和人口规模）的地理区域（如城市和农村地区）开展WBE研究的重要性。通过提供对人群水平AMR的全面理解，该方法可为更有效的公共卫生干预措施提供信息和支持。

该研究聚焦于抗菌药物耐药性（AMR）这一全球重大公共卫生威胁。AMR导致微生物在抗菌药物存在下存活能力下降，2019年造成约120万人死亡，若缺乏预防措施，预计到2050年将升至每年1000万人死亡。抗菌药物在人类医学、畜牧业和农业中的过度使用和误用导致抗菌药物耐药细菌（ARBs）和抗菌药物耐药基因（ARGs）的流行率上升，使感染更难治疗。传统基于医疗机构的监测主要针对临床病例中分离的特定人类病原体，无法反映AMR全貌，因其排除了新兴耐药性以及共生菌和环境细菌等主要AMR基因携带者。基于废水的流行病学（WBE）能够提供社区层面的AMR综合视角，被视为临床监测的有前景的补充工具。COVID-19大流行期间，通过城市污水监测病毒流行率和变异株传播的系统已成功实施并延续至今。欧盟城市废水处理指令修订版和意大利国家抗微生物耐药性应对计划均已纳入基于城市污水的永久性AMR监测项目。从方法学角度，污水中的AMR可通过培养法和宏基因组DNA方法进行评估。WHO提出的Tricycle方案是用于量化产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL-Ec）的唯一标准化程序，但单一靶标提供的信息有限。宏基因组DNA分析可同时定量多种ARGs，或通过下一代测序（NGS）进行非靶向全面评估。然而，意大利大多数相关研究聚焦于评估污水处理厂运行效率或环境影响，少数研究使用废水监测追踪AMR在人群中的扩散，且多为单一方法。全球WBE研究 largely 聚焦城市地区，尽管城乡健康差异已得到充分证实，人口密度和规模已被认定影响废水耐药组的丰度和组成，但城乡废水的实际点对点比较仍然缺乏。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在通过培养和宏基因组DNA方法相结合，调查城乡地区ARBs和耐药基因的流行情况。

研究人员采集了2024年4月至9月期间意大利特伦托省（东北部）七家市政污水处理厂（WWTPs）的42份原始废水样本。这些WWTPs分布在620 resale 公里2的区域内，但根据 vocation、市镇数量和人口规模可明确分为城市组（WWTP1、2、3，服务人口17,000–86,000人，设计处理能力95,000–120,000人口当量）和农村组（WWTP4、5、6、7，服务人口1,800–4,400人，设计处理能力1,000–7,000人口当量）。其中WWTP2和WWTP3接收医院废水（分别为4家医院852张床位和2家医院367张床位）。城市组基于BOD₅计算的人口当量大于50,000，农村组小于5,000。

**3.2 ESBL-Ec流行率**

研究人员采用基于WHO Tricycle协议的平板计数法对42份污水样本中的总大肠杆菌（E. coli）和ESBL-Ec进行计数。所有样本中均检测到E. coli和ESBL-Ec，中位负荷分别为2.72×10⁶ CFU/100 mL和9.75×10⁴ CFU/100 mL。ESBL-Ec在总E. coli中的比例中位值为3.8%（四分位距=3.68%）。WWTP2和WWTP3（含医院的密集城市化区域）显示最高的中位值（分别为6.34%和6.01%），而WWTP6（小型农村地区）最低（1.90%）。汇总数据显示，城市地区ESBL-Ec流行率（5.41%）显著高于农村地区（3.30%）（Wilcoxon秩和检验，p<0.01）。

**3.3 ARGs和intI1的丰度**

通过qPCR和dPCR定量了8种ARGs及intI1基因的绝对丰度，并以16S rRNA基因作为内参计算相对丰度。总体而言，intI1为最丰富的基因，其次为sul1 > ermB > qnrS > tetA > blaCTX-M > blaKPC > vanA ≈ mecA。所有基因在各取样点至少一份样本中检出，但blaKPC和vanA仅在90.5%和66.7%的样本中检出，且大多数阴性样本来自农村区域WWTPs，而城市区域样本几乎均为阳性（仅WWTP1一份样本vanA阴性）。比较不同位点时，blaKPC的差异最显著，intI1、sul1、qnrS、blaCTX-M和vanA次之。城乡比较显示，blaKPC、vanA和ermB的相对丰度在城市地区显著更高（Wilcoxon秩和检验，p<0.0001）。Spearman相关性分析显示，blaKPC、vanA和ermB的相对丰度与人口规模呈显著正相关；intI1、sul1和tetA之间存在强正相关；blaKPC与blaCTX-M及qnrS、vanA与blaKPC和ermB之间存在较弱但显著的正相关。多数基因随废水样本温度升高呈增加趋势，其中intI1、sul1、tetA和mecA的相关性显著。

**3.4 细菌群落特征**

通过Illumina NGS对16S rRNA基因V5–V6高变区进行测序，每份样本获得28,373–453,704条高质量非嵌合序列，共鉴定7,326个扩增子序列变体（ASVs）。去除非细菌序列和稀有ASVs（<0.5%）后，各样本 rarefied 至26,500条reads。Shannon指数计算的α多样性在不同WWTPs或城乡区域间无显著差异。Bray–Curtis相异性和加权UniFrac距离计算的β多样性分析显示，除WWTP6与WWTP7之间存在唯一显著差异（p<0.042）外，不同WWTPs样本间细菌群落无显著差异，城乡区域间亦无显著差异。

分类学分析显示，最丰富的门（>3%）为假单胞菌门（Pseudomonadota，平均66.87%）、芽孢杆菌门（Bacillota，10.75%）、拟杆菌门（Bacteroidota，11.73%）、弯曲菌门（Campylobacterota，5.12%）和放线菌门（Actinomycetota，4.01%）。152个不同属中仅10个属平均相对丰度超过1%，分别为不动杆菌属（Acinetobacter，26.33%）、气单胞菌属（Aeromonas，7.05%）、弓形菌属（Arcobacter，5.10%）、黄杆菌属（Flavobacterium，4.06%）、cloacibacterium（3.85%）、trichococcus（2.20%）、enhydrobacter（2.06%）、假单胞菌属（Pseudomonas，1.92%）、simplicispira（1.34%）和链球菌属（Streptococcus，1.08%）。值得注意的是，仅链球菌属在城乡区域间显示出统计学显著差异。

**3.5 细菌优先病原体的丰度**

在平均相对丰度>1%的10个属中，不动杆菌属、假单胞菌属和链球菌属包含WHO细菌优先病原体清单（BPPL 2024）中列出的已知ARBs物种。多数位点中，不动杆菌属和假单胞菌属相对丰度随时间下降，而链球菌属上升。Spearman相关性分析显示，链球菌属与人口规模呈显著弱正相关，并与intI1及sul1、tetA、mecA、blaKPC、ermB和vanA等多种ARGs正相关；假单胞菌属与sul1和mecA呈负相关，仅与qnrS正相关；不动杆菌属与intI1、sul1和tetA负相关。温度方面，链球菌属与废水样本温度呈强正相关（ρ=0.86），而不动杆菌属（ρ=-0.46）和假单胞菌属（ρ=-0.61）呈负相关。

研究讨论部分指出，WBE被视为快速有效收集AMR传播和流行信息的补充工具。本研究整合培养法和分子方法，对意大利一个省份的城乡区域进行了比较。ESBL-Ec的量化显示其广泛传播，总体中位值3.8%与意大利先前调查及欧洲其他国家数据一致。城市地区，尤其是含医院的区域，ESBL-Ec流行率更高，这与德国和瑞士的类似趋势报告一致，表明较高人口密度和医院存在可能促进ESBL-Ec传播。

在ARGs方面，intI1及sul1、tetA、qnrS等环境和人病原体中广泛存在的基因在各区域丰度相似，确认其在环境细菌和共生菌群中的高流行性。临床相关ARGs中，ermB丰度最高，与意大利大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B（MLS）类药物高消费量一致，且城市地区显著更高。blaCTX-M、blaKPC、vanA和mecA丰度较低，其中blaCTX-M为最丰富的该类基因。值得注意的是，blaKPC和vanA无法在某些农村样本中检出，且城市地区显著更高，这与城市人口密度高及医院存在相关。WWTP2和WWTP3因接收医院废水而始终显示最高的blaKPC和vanA基因丰度。mecA作为最低丰度的基因，与其主要与医院污水而非社区污水的关联一致。部分临床相关ARGs的共现提示多重耐药（MDR）细菌株的存在。温度升高与多数ARGs丰度增加相关，可能反映高温促进携带ARGs的微生物增殖并促进水平基因转移（HGT）。

细菌群落结构在各WWTPs间相对均一，可能因样本源自同一省份的有限地理区域。最丰富的门与全球污水细菌核心群落的报道一致。在可能包含WHO BPPL优先ARBs的属中，不动杆菌属和假单胞菌属随时间减少，而链球菌属增加，可能与气候和人为因素相关。链球菌属与多数ARGs的正相关与其对红霉素、四环素、青霉素、头孢菌素和氟喹诺酮等药物的耐药性上升一致，鉴于意大利包括特伦托省侵袭性肺炎链球菌病通知率上升，此观察尤为重要。相比之下，不动杆菌属未与任何ARGs显示共现，与特伦托省过去5年未报告碳青霉烯耐药不动杆菌临床分离株的全国监测数据一致。假单胞菌属仅与qnrS呈正相关，与意大利该属对氟喹诺酮和碳青霉烯耐药率下降的趋势相符，特伦托省碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌从2022年14%降至2024年8.8%。

**研究结论**

基于废水的监测表明，ESBL-Ec的流行率以及临床意义显著的ARGs（特别是ermB、blaKPC和vanA）的丰度在城市地区高于农村地区。NGS对废水细菌群落的表征显示不动杆菌属、假单胞菌属和链球菌属等可能包含WHO BPPL中报告的ARBs的种群丰度较高。本研究强调了在不同特征（vocation、市镇数量和人口规模）的地理区域实施WBE研究的重要性。该方法通过提供对人群水平AMR趋势的更深入 comprehensive 理解，有助于更有效的公共卫生干预。