慢性髓性白血病患者无治疗缓解与分子学复发的综合分子特征解析：EURO-SKI 生物标志物研究

《Leukemia》：Comprehensive molecular characterization of treatment-free remission and molecular relapse in chronic myeloid leukemia patients: the EURO-SKI Biomarker Study

　　

欧洲停用激酶抑制剂（EURO-SKI）试验旨在研究慢性髓性白血病（CML）患者酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的停药问题。持续性无治疗缓解（TFR）及TFR丧失的分子机制目前仍知之甚少。为解决这一问题，研究人员开展了全转录组基因表达分析，并结合基于NanoString nCounter的绝对基因定量。研究人员评估了240例CML患者在TKI服用最后一天的外周血白细胞基因表达情况（训练样本：n = 122；验证样本：n = 118），并纳入10名健康对照。为识别TKI特异性机制，研究中还整合了来自外部数据集的96例未经TKI治疗的CML患者转录组数据。TFR患者显示出GATA1、KLF1和MYBL1调控子（regulon）的激活，这一特征与红系祖细胞（erythroid progenitor cells）相符。TFR患者维持了先天免疫（如自然杀伤细胞和树突状细胞）与适应性免疫（如CD8⁺、CD4⁺及γδ T淋巴细胞）之间持续的相互通讯，其模式与健康对照中观察到的情况相似。相反，这种细胞间通讯在TFR丧失患者中发生破坏。此外，研究人员鉴定出一个FLT3阈值，可将患者区分为TFR丧失概率显著不同的两组。利用能够重建或增强先天免疫与适应性免疫之间通讯的机制，可能是实现持久TFR的关键。

该论文发表于《Leukemia》，依托欧洲停用酪氨酸激酶抑制剂研究（EURO-SKI）这一目前评估慢性髓性白血病（CML）停用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）规模最大的临床试验，系统解析了无治疗缓解（TFR）与分子学复发之间的分子基础。CML患者在接受TKI治疗后，约有近一半能够在停药后维持主要分子学缓解（MMR），即实现TFR；但另一部分患者会在停药后失去MMR，发生分子学复发。临床上，如何识别哪些患者适合安全停药、哪些患者复发风险较高，始终是精准治疗的重要问题。既往研究提示，TFR的维持并不只是白血病负荷降低的结果，更与免疫监视状态密切相关，但相关机制复杂，且缺乏经过独立验证的可靠生物标志物。因此，开展本研究的必要性在于，通过系统的转录组与免疫分子特征分析，寻找可解释TFR维持与丧失的关键通路、调控因子与潜在预测指标。

研究人员纳入240例EURO-SKI患者，分别构成训练样本和验证样本，并纳入10名健康志愿者作为对照。所有患者均处于慢性期，接受TKI治疗至少3年，并维持深度分子学缓解（DMR）至少1年。研究重点分析患者在停药前最后一天外周血白细胞的基因表达特征，以捕捉停药时决定后续结局的分子状态。研究结果表明，TFR患者与复发患者在停药时已存在可识别的分子分层：TFR患者表现出以细胞毒性淋巴细胞活化、红系相关转录调控及先天—适应性免疫协同为特征的分子图谱，而复发患者则更倾向于呈现免疫失衡与炎症相关特征。研究还提出，FLT3表达阈值可将患者区分为复发风险显著不同的两组，提示其具有潜在临床转化价值。

在技术方法方面，研究主要采用以下几类关键手段：首先，对训练样本进行全转录组芯片分析（Clariom D arrays），并以limma和GSEA开展差异表达与通路富集分析；其次，利用NanoString nCounter对候选基因面板进行绝对定量，并在独立验证样本中检验；再次，借助ARACNe-AP与msVIPER开展主调控因子（master regulator）/调控子活性推断；同时应用xCell进行免疫细胞去卷积分析，并通过相关矩阵与弦图刻画免疫细胞互作；此外，研究还进行一致性独立成分分析（consensus ICA）以识别无监督转录程序。样本来源包括EURO-SKI试验外周血队列，以及Adelaide和Seattle两个公开CML诊断期数据集。

研究结果部分可概括如下。

Patient characteristics
研究人员首先描述了研究队列的构成与临床特征。240例患者分别来自Mannheim和Lund两个中心，构成训练与验证样本，两组在TKI治疗时长和DMR持续时间方面相近，中位TKI治疗时间分别为7.6年和7.7年，中位DMR持续时间分别为4.3年和4.5年。停药后多数复发事件发生在前6个月，36个月TFR丧失累积发生率在训练样本中为49%，在验证样本中为57%。这一结果说明，停药后早期是分子学复发的高风险窗口，也为后续围绕停药时分子状态开展分析提供了临床依据。

Master regulators driving TFR/relapse phenotypes
通过停药当日外周血白细胞差异表达分析，研究人员识别出TFR与复发两种不同分子表型。TFR患者上调GZMA、GZMH、GZMK、NKG7、FCRL6等基因，这些基因主要与自然杀伤（NK）细胞和CD8⁺ T淋巴细胞相关，提示细胞毒性免疫活性增强。复发患者则出现促炎与抗炎基因的共同高表达，反映免疫调节失衡。GSEA进一步显示，TFR患者富集免疫激活及干扰素（IFN）相关基因签名，而复发患者富集促炎通路。为超越单纯转录水平变化、逼近蛋白活性层面的调控状态，研究人员开展调控子分析。结果显示，TFR患者激活GATA1、KLF1和MYBL1调控子，这些因子是红系谱系的重要主调控因子，提示维持TFR与红系祖细胞相关转录程序有关；而复发患者则表现出IL1RL1等调控活性增强，与IL1R相关炎症信号一致。POU家族多个转录因子在两类结局中也显示差异激活，提示其可能参与TFR/复发生态系统中的免疫调控。

Immune dysregulation characterizes relapse
在免疫微环境层面，研究人员利用xCell对外周血转录组进行免疫细胞丰度推断，并与健康对照和未经TKI治疗的诊断期CML数据进行比较。结果显示，诊断时CML患者富集髓系祖细胞，而接受长期TKI治疗后，患者表现为髓系祖细胞减少、淋巴系祖细胞增加。总体而言，更好的治疗应答与更高的淋巴细胞富集评分相关。TFR患者中，浆细胞样树突状细胞（pDC）和NK细胞富集程度较高，尽管其绝对评分较低，仍提示这些细胞可能参与TFR维持。更重要的是，研究人员通过免疫细胞相关性图谱揭示了TFR与复发在“免疫通讯结构”上的本质差异：在TFR患者和健康对照中，CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、pDC及B淋巴细胞之间存在正相关，说明适应性免疫与抗原呈递网络维持协调；中性粒细胞和NKT细胞则与多数T细胞亚群呈负相关。上述模式在复发患者中消失，提示复发并非仅由单个细胞群缺陷导致，而是整个免疫互作网络的瓦解。弦图分析进一步强调，pDC在TFR患者中与多种免疫细胞存在特异而显著的正相关，显示其可能是连接先天免疫与适应性免疫的关键节点。研究还在诊断期外部队列中观察到类似规律：早期分子学应答良好的患者保留了pDC与B/T淋巴细胞的正相关，而应答差者缺失该相关性。独立成分分析进一步识别出一个在TFR患者中活性更高的转录程序，该程序与先天和适应性免疫功能相关，并与CD8⁺效应记忆T细胞丰度强相关，独立支持了T细胞驱动免疫程序与成功TFR的联系。

Prognostic influence of novel biomarkers on TFR
为筛选可用于预后的分子标志物，研究人员构建了包含189个基因的候选面板，并在训练样本中进行NanoString绝对定量。质控后有163个基因进入分析。单因素Cox回归发现16个基因与MMR丧失风险显著相关，多因素模型中仍保留4个独立相关基因。进一步比较TFR与复发组表达差异时，CD3G、FLT3和KIR3DL1在训练样本中差异显著。由于训练样本事件数有限，研究未建立新的完整预测模型，而是采用最小P值法结合bootstrap重抽样，为多因素模型中的基因寻找稳健阈值。最终，FLT3的6.40阈值被确定为最佳切点。尽管16个候选基因在独立验证样本中未能重复单基因风险关联，但FLT3的6.40阈值在验证样本中仍可将患者分为MMR丧失风险显著不同的两组。这表明，相较单纯连续变量比较，FLT3作为分层阈值具有较好的可重复性。结合已有生物学知识，FLT3不仅是造血祖细胞标志，也参与pDC发育分化，因此其与TFR的关联可能反映了pDC介导抗白血病免疫反应的维持状态。

Deep versus fluctuating molecular remission
研究还对停药24个月后持续缓解患者中的分子波动现象进行了探索性分析。在55例达到36个月至少维持MMR且24个月后有不少于3次分子监测的患者中，44例属于“深度缓解”，11例属于“波动性缓解”。研究发现12个基因的表达与波动状态显著相关，其中DSC2、PIK3CB、CD86和TLR6差异最为明显。值得注意的是，CD86是pDC相关标志，提示即便在未复发患者内部，免疫活化程度仍可能影响分子学稳定性。不过作者明确指出，这一部分仅为探索性发现，因缺乏验证队列支持，仍需其他队列进一步确认。

讨论部分强调，本研究从多层次证据支持了免疫监视在TFR维持中的核心作用。TFR患者表现出NK细胞和CD8⁺ T细胞细胞毒性相关基因上调，同时保留了pDC、B细胞与T细胞之间的协调互作；复发患者则体现出炎症调节失衡及免疫通讯中断。研究还揭示了GATA1/KLF1/MYBL1等红系主调控因子的激活，提示CML中由髓系向红系表型转变可能与优良分子学结局有关。另一方面，IL1R相关信号在复发中增强，提示其可能与白血病干细胞免疫靶向脆弱性相关。作者同时指出，POU2F1、POU2F2和POU2AF1等转录因子可能参与TFR/复发生态系统，但其在CML中的作用仍有待进一步明确。研究局限包括采用批量转录组而非单细胞分辨率、缺乏功能实验、非欧洲人群代表性不足，以及训练样本事件数量有限，因而难以构建稳健的新型预测模型。尽管如此，该研究仍为理解停药后免疫稳态和复发机制提供了系统框架，并为FLT3等潜在生物标志物的后续开发奠定基础。

研究结论可译为：本研究结果表明，TFR患者维持了先天免疫（NK细胞、pDC）与适应性免疫（如CD8⁺、CD4⁺及γδ T淋巴细胞）之间持续的相互通讯，这一模式与健康对照中观察到的情况相似；而这种细胞间通讯在复发患者中遭到破坏。对停用TKI后复发与持续TFR的CML患者开展骨髓单细胞RNA测序，对于阐明这种免疫失调的发病机制至关重要。研究结果提示，免疫系统预激可能发生于CML疾病早期阶段。此外，研究人员鉴定出一个FLT3阈值，可将患者区分为TFR丧失概率显著不同的两组。FLT3在白血病中的作用似乎具有“双刃剑”特征，因此需要功能实验进一步明确FLT3在维持CML特异性免疫应答中的作用。利用能够重建或增强先天免疫与适应性免疫之间通讯的机制，可能是实现持久TFR的关键。