祖先与现代家族-1糖基水解酶（Glycosidase，GH1）的底物谱比较

《Protein Science》：Substrate scope of ancestral versus modern family-1 glycosidases

　　

实验研究表明，基于祖先序列重建（Ancestral Sequence Reconstruction，ASR）的蛋白质工程可获得具有生物技术价值的生物分子特性，包括高热稳定性、增强的构象柔性和改变的催化范围。碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZymes）在碳水化合物及糖缀合物的降解与合成中有广泛应用。本文探讨祖先重建如何影响糖基水解酶——即催化所有活细胞中糖苷键水解并可催化合成反应的高度多样化酶类——的底物谱。为此，研究人员筛选了291种潜在糖基水解酶底物，分别由嗜盐嗜热菌Halothermothrix orenii的现代家族-1糖基水解酶和源于细菌-真核生物共同祖先推定的祖先家族-1糖基水解酶进行降解。现代酶对多数底物催化效率更高，但祖先糖基水解酶对带有大苷元（aglycone）部分的黄酮苷（flavonoid glycosides）更高效。对选定底物催化参数的分析，结合利用监督学习算法对文库数据的分析表明，现代酶的催化效率随底物尺寸增大而下降，而祖先糖基水解酶未观察到此趋势。分子建模显示，祖先糖基水解酶的催化模式与其蛋白中存在高度柔性区域及可容纳大苷元的空腔有关。研究结果可为设计用于合成和水解大分子量糖缀合物的酶提供指导。

论文解读：祖先与现代家族-1糖基水解酶（Glycosidase，GH1）的底物谱比较

本研究发表于《Protein Science》。糖基水解酶（Glycosidase/Glycoside Hydrolase，GH，碳水化合物活性酶 Carbohydrate-Active enZYmes，CAZymes 之一）可高效催化糖苷键水解，也可在热力学有利条件下催化逆反应合成糖缀合物。现代GH1家族酶通常对糖基供体（糖）及糖苷键构型（α/β）具特异性，但对苷元（aglycone）部分有一定混杂性（promiscuity）。祖先序列重建（Ancestral Sequence Reconstruction，ASR）"复活"的祖先蛋白常表现出高于现代同源蛋白的热稳定性、构象多样性及催化混杂性，被认为与早期生命环境适应及进化可塑性（evolvability）相关。然而ASR如何影响GH1底物谱特别是对不同尺寸苷元底物的耐受性尚缺乏系统性研究。本研究以嗜盐嗜热菌Halothermothrix orenii的现代GH1酶与推定的细菌-真核生物共同祖先GH1（系统发育节点Node 72）为对象，通过大规模底物筛选、动力学表征、监督学习分析及分子建模，探究祖先重建对GH1底物范围的影响，明确祖先酶对大苷元黄酮苷的高效催化源于特定柔性区及额外空腔，为糖缀合物合成/水解用酶的底物结合口袋（binding pocket/cavity）工程提供指导原则。两酶均具TIM桶（triosephosphate isomerase barrel，TIM-barrel）折叠及相近变性温度（T_m），但序列一致性仅58%，祖先酶特定区域构象柔性显著增高。

主要关键技术方法：

研究人员以现代GH1（Halothermothrix orenii）及ASR重建的祖先GH1（Node 72，细菌-真核生物共同祖先推定序列）为研究对象，进行：(1) 基于AstraZeneca内部化合物库筛选约500个含己糖/戊糖水基且具氧苷键的潜在底物，经UPLC–MS检测291个可检底物在24 h、~17 μM酶浓度下的转化情况；(2) 对代表性小分子报告底物及黄酮苷测定Michaelis–Menten动力学参数（k_cat、K_M、k_cat/K_M）；(3) 使用Boltz-1深度学习共折叠预测酶-底物复合物，Fpocket/CaverWeb识别空腔，MM-GBSA计算结合自由能ΔG_bind；(4) 对文库筛选数据采用RDKit分子描述符及决策树（Decision Tree，Gini指数）监督学习分类分析现代/祖先偏好性底物特征。

2 RESULTS

2.1 Library screening for glycoside bond cleavage with the modern and ancestral proteins

研究人员对291个经LC–MS检出的化合物进行定性分类（无转化/<5%、不完全转化/5%–95%、完全转化/>95%）。结果：176个底物两酶均无转化；55个底物两酶均完全转化；60个底物至少一酶有不完全转化。其中narirutin、linarin、hesperidin三种黄酮苷仅祖先酶实现24 h完全转化而现代酶不能。表明祖先GH1对大苷元黄酮苷具独特催化能力。

2.2 Analysis of Michaelis–Menten catalytic parameters for a selected set of substrates

研究人员对pNP-glu、pNP-gal、MUB-gal、RES-gal、FMG-gal、RED-gal及三种黄酮苷测定动力学参数。现代酶k_cat/K_M跨越约6个数量级且随底物分子量增大显著下降；祖先酶对各底物k_cat/K_M相差≤2个数量级且无随分子量下降的趋势。祖先酶对黄酮苷催化效率显著高于现代酶（k_cat/K_M比值约10²），而对小分子量人工底物（如pNP-glu）现代酶更优。结论：现代GH1催化效率随底物尺寸增大而降低，祖先GH1无此限制，故对大苷元底物更优。

2.3 Molecular modeling provides insights into the interaction of glycosides with the modern and ancestral glycosidases

研究人员用Boltz-1共折叠预测酶-底物复合物。祖先酶中苷元部分容纳于由短/中等侧链疏水残基构成、毗邻活性位点的相邻空腔中，该区属构象柔性区；现代酶此空腔被芳香族大侧链残基填充。以底物最大原子间距（maximum inter-atomic distance）替代分子量作催化效率相关性分析拟合度显著提高。结论：祖先酶柔性区形成可容纳大苷元之空腔是高效催化黄酮苷的结构基础，底物空间尺寸比分子量更能反映催化趋势。

2.4 Computational analysis of glycoside-binding cavities in the modern and ancestral glycosidases

研究人员用Fpocket分析Boltz-1预测结构。两酶均有糖基结合活性位点空腔，但仅祖先酶在活性位点旁识别出可容纳大苷元之额外空腔（由较小侧链残基围成，现代酶对应位置为大芳香族残基封堵）。MM-GBSA结合能显示小底物两酶结合能相近，大底物祖先酶结合更有利（ΔG_bind更负）。结论：祖先特有空腔直接促进大苷元底物结合。

2.5 Computational analysis of mutational effects on glycoside binding

研究人员比对两酶结构鉴定出构成祖先额外空腔的18个口袋内残基，其中9个在现代酶对应位点为不同氨基酸（多为大→小侧链改变），另4个位点涉及显著构象重排。将现代酶这9或13个位点反向突变为祖先残基（back-to-ancestor mutations）使大底物结合能改善；祖先酶对应位正向突变为现代残基（ancestral-to-modern mutations）使大底物结合变差。结论：多突变组合可通过空腔工程赋予现代酶容纳大苷元能力，Boltz-1+MM-GBSA可指导定向进化起始突变集筛选。

2.6 Analysis of the library data using a supervised learning algorithm

研究人员将文库化合物按现代酶是否明显优于祖先酶分为Set 1（50个）与Set 2（241个），选取RDKit分子描述符经决策树分类。树显示现代酶优势底物集中于低分子量（~447–469 Da）或苷元含多杂环/碳环者；水解底物分子量分布现代酶峰值~450 Da，祖先酶~600 Da。结论：大规模筛选数据印证现代酶偏好小底物、祖先酶较适中等偏大底物（~600 Da"Goldilocks"尺寸），与动力学及建模结论一致。

讨论与结论（翻译浓缩）：

祖先酶对黄酮苷的高效催化引发进化思考——黄酮类为植物/真菌后起源代谢物，而所研究祖先GH1对应节点早于真菌与陆生植物分化，可能祖先GH1本就具备水解大苷元底物能力，黄酮苷仅巧合匹配。除进化意义外，本研究实证ASR可拓宽GH1底物谱至带大苷元糖苷。分子模拟表明祖先酶柔性区存在可容纳大苷元之预形成空腔，现代酶对应区被侧链封堵需更大构象变化方可结合。糖苷酶对苷元本具混杂性可用于糖缀合物合成（如蛋白糖基化疫苗、强心苷），本研究提示理性设计突变生成合适空腔并结合ASR所获构象多样性可促进大苷元底物加工。虽纯理性设计成功率有限，结构建模与结合自由能计算可指导定向进化起始库构建。所得原则有望推广至其他GH家族甚至糖基转移酶（Glycosyltransferase，GT）。

（注：PDB ID——祖先GH1: 6Z1H；现代GH1 H. orenii: 4PTV；CAZy为Carbohydrate-Active enZYmes Database；TIM-barrel即(β/α)₈-barrel折叠）