深度学习引导的CADASIL小鼠模型视网膜血管形态计量量化

《Ophthalmology Science》：Deep learning–guided retinal vascular morphometric quantification in CADASIL mouse models

　　

目的：开发和验证一种可解释的深度学习引导工作流程，用于在伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy, CADASIL）的NOTCH3变异敲入小鼠模型中，定位和量化眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiography, FFA）上的局灶性视网膜管腔病理。

设计：横断面实验成像与计算分析。

对象：32只小鼠（野生型[wild-type, WT] n=12；NOTCH3^C455R[C455R] n=12；NOTCH3^R1031C[R1031C] n=8），产生1,670张可分析的FFA图像。

方法：两个ImageNet预训练的VGG16分类器（WT vs. 各突变品系）采用受试者分组拆分进行训练。Grad-CAM++和遮挡敏感性图（occlusion sensitivity map）定义类别判别性感兴趣区（region of interest, ROI）。基于中心线的形态计量学流程沿有序血管中心线采样管腔直径 extracellular-regulated, this sentence seems incomplete. Let me continue with the rest.

...管腔直径，计算平均直径、最大直径、直径变异系数（coefficient of variation, CV）和迂曲度（tortuosity）。快速傅里叶变换（fast Fourier transform, FFT）衍生的血管串珠指数（vessel beading index, VBI）利用归一化带限频谱功率量化周期性直径振荡。对大血管和小血管掩膜在全视野和ROI限定域中计算指标。额外的稳健性分析评估了保留测试、样本外显著性、ROI阈值敏感性、替代VBI空间周期频段和重复平衡再训练。

主要结局指标：主要生物学结局为全视野和ROI限定分析中的大血管平均直径、最大直径和血管串珠指数（VBI）；分类器判别性能（AUC）作为定位框架的支持性性能指标报告。

结果：全视野形态计量学检测到两种突变体相对于WT的广泛性大血管扩张（平均直径：WT 27.82 μm；C455R 30.94 μm；R1031C 32.03 μm；P≤0.001），伴迂曲度降低（P<0.001），而全视野最大直径和VBI仅呈方向性增加。ROI限定分析放大了局灶性病理：在Grad-CAM++ ROI内，大血管最大直径增加（WT 37.62 μm；C455R 48.46 μm；R1031C 45.66 μm；P<0.001），VBI增加（WT 1.75；C455R 3.04；R1031C 2.93；P≤0.001）。遮挡ROI显示一致的VBI增加（WT 2.11；C455R 3.84；R1031C 4.90；P<0.001）。小血管ROI差异微小。主要的大血管ROI限定表型在各稳健性分析中保持方向稳定，保留测试证实两种基因型比较中分类器判别性能均高。

结论：FFA上的可解释深度学习引导定位可识别疾病信息性血管节段，并实现局灶性管腔扩张和周期性串珠的敏感量化，这些特征被全视野平均值所稀释。该框架可能支持CADASIL视网膜生物标志物的开发和纵向监测。

伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy, CADASIL）是一种遗传性小血管病，由致病性NOTCH3突变引起。该疾病以血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）和周细胞退化、颗粒状嗜锇物质（granular osmiophilic material, GOM）沉积为特征，导致脑及其他器官的进行性动脉病变和缺血性损伤。尽管已有研究记录了视网膜血管与脑动脉类似的病理改变，但临床上CADASIL的视网膜影像学表现异质性较大，从动脉狭窄到轻微或不可检出的变化均有报道，且尚无明确的形态学指标能够最佳捕捉疾病固有的动态管腔病理。现有视网膜血管指标多源自眼底照相，依赖基于反射光强梯度的表观血管边界界定，易受中央光反射偏倚影响，且多采用视盘中心采样方案，对局灶性或节段性直径异常敏感性不足。据此，研究人员在《Ophthalmology Science》发表了这项研究，旨在整合眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiography, FFA）、沿径管腔形态计量学和可解释人工智能（explainable artificial intelligence, XAI）引导的感兴趣区（region of interest, ROI）选择，以识别CADASIL视网膜血管重塑的特异性管腔标志物，并探索XAI聚焦定量分析的应用价值。

研究人员开展的研究采用两个NOTCH3人源变异敲入小鼠品系——NOTCH3^C455R（代表更严重的低形态活性状态）和NOTCH3^R1031C（代表较轻的低形态活性状态），通过与内源性Notch3敲除背景杂交并在SM22α-Cre驱动下表达，构建CADASIL模型，以同龄C57BL/6J小鼠作为野生型（wild-type, WT）对照。FFA图像采用Micron IV系统采集，使用25%荧光素钠腹腔注射后进行早期至晚期血管造影相序贯成像，经质量标准筛选后纳入分析。图像预处理包括绿色通道提取、对比度受限自适应直方图均衡化（contrast-limited adaptive histogram equalization, CLAHE）及高斯模糊去噪。大血管（主干/一级分支）采用Bernsen局部阈值法分割，小血管（高级分支/毛细血管前小动脉）采用Niblack局部阈值法分割，后者减去大血管掩膜后获得。分割后的二值掩膜经细化提取单像素宽中心线，在分支点拆分后沿血管路径有序排列，通过欧氏距离变换采样半径并计算直径，进而获取平均直径、最大直径、直径变异系数（coefficient of variation, CV）和迂曲度（path length/chord length ratio），采用长度加权聚合降低短片段敏感性。周期性管腔变化通过快速傅里叶变换（fast Fourier transform, FFT）分析沿径直径信号的功率谱密度（power/N²长度校正）量化，定义目标空间周期带10–100像素的血管串珠指数（vessel beading index, VBI）。

深度学习分类器方面，研究人员以ImageNet预训练VGG16为基础，对WT与C455R、WT与R1031C分别进行二分类训练。采用受试者水平分组拆分防止数据泄露，15%小鼠作为独立测试集，余者行5折交叉验证。训练采用焦点损失（focal loss, γ=2）与类别平衡权重，Adam优化器（学习率1×10^?4，权重衰减1×10^?5），批量大小32，早停（耐心值5）。交叉验证的5个折叠模型通过软投票、硬投票和加权软投票构建集成分类器，以受试者水平平均预测概率计算ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）。可解释性分析采用梯度类激活映射++（Grad-CAM++）和遮挡敏感性两种互补显著性方法，各折叠图经min-max归一化后像素级平均，90th百分位阈值定义高显著性ROI，与血管掩膜相交后获得XAI限定血管区域。

研究结果部分，"数据集特征与深度学习分类器性能"显示共纳入32只小鼠1,670张可分析FFA图像。VGG16分类器在受试者分组评估中显示高判别性能，独立测试集上C455R vs. WT的图像级/受试者级软投票AUC分别为0.984和1.000，R1031C vs. WT均为1.000。"C455R与WT比较"中，全视野大血管分析显示C455R平均直径增大（27.82 μm vs. 30.94 μm；P=0.001）、迂曲度降低（P<0.001），但最大直径、CV和VBI未达校正显著性；小血管仅CV有方向性增加。XAI限定分析则放大局灶病理：Grad-CAM++ ROI内大血管平均直径（25.04 μm vs. 30.70 μm；P<0.001）、最大直径（37.62 μm vs. 48.46 μm；P<0.001）、CV（0.22 vs. 0.27；P=0.006）和VBI（1.75 vs. 3.04；P=0.001）均显著增加；遮挡ROI显示一致性VBI升高（2.11 vs. 3.84；P<0.001）。小血管ROI差异不显著。样本外显著性策略、80th–97.5th阈值敏感性分析及5–150、15–100、20–80像素替代VBI频带分析均证实大血管VBI升高的方向稳定性。

"R1031C与WT比较"中，全视野大血管同样显示R1031C平均直径增大（32.03 μm；P<0.001）和迂曲度降低（P<0.001）。XAI限定分析中，Grad-CAM++ ROI内大血管平均直径（31.80 μm；P<0.001）、最大直径（45.66 μm；P<0.001）和VBI（2.93；P<0.001）显著升高；遮挡ROI中上述指标及CV均显著增加。小血管仍无稳健差异。样本外策略、全阈值范围敏感性分析及多频带VBI分析保持一致方向性。针对R1031C图像数不平衡的重复平衡再训练（10次）显示，测试集图像级和受试者级AUC均维持1.000。

讨论部分，研究人员指出该研究整合FFA、深度学习与中心线形态计量学实现了CADASIL视网膜血管重塑的体内表征。FFA直接描绘灌注管腔，减少对外壁反射线索的依赖；连续中心线采样可检测可能被视盘中心采样稀释的空间结构化直径变化。人类CADASIL视网膜表现异质性大，包括动脉狭窄、动静脉压迹、棉絮斑等，而光学相干断层扫描血管成像（OCT angiography, OCTA）和自适应光学成像研究发现静脉扩张、壁增厚、管腔缩小及血管反应性受损等。本研究的小鼠发现应理解为候选性节段性管腔重塑表型，而非人类发现的直接复制，需经人类FFA、OCTA及高分辨率结构成像数据集验证。XAI限定分析放大局灶病理的生物学合理性在于：CADASIL主要为壁细胞/血管平滑肌细胞动脉病变，大血管有连续的血管平滑肌覆盖，而毛细血管床以周细胞为主，故大血管信号更强。VBI作为周期性振荡指标，较仅反映离散度的CV更具空间特异性，可能反映收缩性壁功能节段性丧失后继发纤维化导致的交替扩张-收缩区带。两种XAI方法（Grad-CAM++与遮挡敏感性）的收敛性增加了发现真实病理而非单一解释技术伪影的信心。研究局限性包括样本量小、年龄性别未完全平衡、未区分动静脉（早期相FFA不一致）、麻醉对血管张力的潜在影响，以及VGG16架构选择的务实性限制。

研究结论为：在FFA训练的深度学习模型可突出显示局灶性血管扩张和周期性串珠；尽管这些病理特征在全图像平均中被稀释，但通过AI识别区域内的中心线基础频谱形态计量学可对其进行稳健检测。这一整合框架为识别具有潜在转化应用价值的人类CADASIL小血管病视网膜生物标志物提供了一种可解释的方法。