《Cancer Research Communications》：SD population dynamics (n = 31). Sankey diagram illustrati...
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丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-RAF（BRAF）V600突变在转移性结直肠癌（mCRC）中预示着不良预后。莫斯哌非尼（mosperafenib）是一种新型的"悖论突破型"BRAF抑制剂（BRAFi）。研究人员在该项Ⅰ期研究（ISRCTN13713551）的分析中，评估了循环肿瘤DNA（ctDNA）作为莫斯哌非尼单药治疗BRAF V600突变mCRC的预后及预测性生物标志物的价值。研究纳入49例可进行生物标志物评估的mCRC患者（均为BRAF V600突变；其中23例为BRAFi初治，26例为BRAFi经治）。血浆样本在基线及多个时间点纵向采集。ctDNA水平采用肿瘤非依赖性和肿瘤依赖性检测方法进行定量，并与RECIST 1.1缓解情况及无进展生存期（PFS）进行相关性分析。同时评估突变图谱以识别耐药机制。结果显示，低基线ctDNA（≤10%肿瘤分数）具有预后价值，预示更长的中位PFS（mPFS；284天 vs. 59天；HR = 0.32，P = 0.00051）。早期ctDNA动态变化具有高度预测价值；第1周期第15天（C1D15）ctDNA降低≥75%（"分子应答"）与更长mPFS相关（281天 vs. 43天，P < 0.0001）。该分子应答在所有BRAFi初治患者中发生，而在BRAFi经治患者中仅占48%。预先存在的MAPK通路耐药突变在BRAFi经治队列中普遍存在且预示不良结局（HR = 3.5，P = 0.003），而BRAFi初治患者则在疾病进展时获得这些突变。研究表明，ctDNA是莫斯哌非尼治疗BRAF V600突变mCRC的强大生物标志物。低基线ctDNA具有高度预后价值，而C1D15早期的深度分子应答则预示持久获益。该应答主要限于BRAFi初治患者，因为BRAFi经治患者中预先存在的MAPK通路改变与缺乏应答相关。这些发现支持将早期ctDNA动态作为未来临床试验的疗效终点。研究意义：该研究在莫斯哌非尼治疗的BRAF V600突变mCRC中证实了ctDNA的转化应用价值。低基线ctDNA与更长PFS相关，且早期深度分子应答预测持久临床获益，支持其作为早期疗效终点的应用。此外，ctDNA监测有助于识别耐药机制。
转移性结直肠癌（mCRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。BRAF基因第600位缬氨酸突变（BRAF V600）在约8%至12%的mCRC患者中被检出，且在微卫星稳定背景下，该突变是不论疾病分期的不良预后因素。该突变导致BRAF蛋白及其下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的组成性激活。尽管针对该致癌驱动基因已开发出靶向治疗药物，但第一代BRAF抑制剂（BRAFi）单药治疗会导致磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-ERK）信号恢复及表皮生长因子受体（EGFR）激活，即所谓的"悖论性"MAPK通路再激活。临床上通过将BRAFi与EGFR抑制剂及化疗联合应用来对抗这一现象。莫斯哌非尼是一种新型、可穿透血脑屏障的BRAFi，旨在克服上述悖论效应，在临床前模型中显示出良好的抗肿瘤活性。
循环肿瘤DNA（ctDNA）由肿瘤细胞释放至血液中，可提供患者特异性的疾病信息，捕获肿瘤异质性并实现治疗反应的实时监测。可检测的ctDNA提示存在残留病灶，尽管ctDNA水平在个体间存在高度变异性，但个体内变化与总肿瘤负荷相关，并可反映治疗反应或复发。因此，治疗中ctDNA的变化有望成为预测性药效学（PD）生物标志物。虽然早期ctDNA应答目前尚未被验证为早期疗效终点，但监管机构鼓励将ctDNA动态分析与影像学检查相结合，以评估抗肿瘤活性并生成试验特异性证据，用于支持早期ctDNA应答分析的效用，从而指导后续试验设计，最终目标是为患者更快带来新疗法。
既往研究显示，在encorafenib（BRAFi）联合cetuximab（EGFR单抗）的Ⅲ期临床试验中，基线BRAF V600E变异等位基因频率（VAF）较低的患者具有更长的总生存期（OS），且不受基线协变量影响。基于此，研究人员评估了莫斯哌非尼单药治疗中基线BRAF V600突变VAF及ctDNA水平的预后价值。此外，为最大化纵向监测的可评估队列，研究人员根据样本可及性，分别采用肿瘤依赖性（FoundationOne Tracker, F1T）和肿瘤非依赖性（FoundationOne Liquid CDx, F1LCDx）检测方法评估疾病负荷，以评价ctDNA水平动态变化的预测价值。最后，研究人员使用F1LCDx分析获得的停药时血浆样本，分析突变图谱以检测预先存在及新出现的耐药机制。
该研究为Ⅰ期首次人体剂量递增研究（WP43295），纳入经组织学确认、BRAF V600突变的mCRC患者，入组前需经FDA批准或CE-IVD检测证实突变状态。共92例患者基于当地检测的BRAF V600突变状态入组，其中80例纳入安全性和临床结局评估，51例进入结直肠癌生物标志物分析亚组。在51例接受莫斯哌非尼单药治疗的结直肠癌患者中，26例（51%）曾接受BRAFi治疗。生物标志物可评估人群共49例（2例因回顾性评估为BRAF V600野生型而被排除），其中BRAFi初治23例，BRAFi经治26例（包括既往BRAFi+cetuximab 20例、既往BRAFi但cetuximab和MEKi初治3例、三种药物均经治3例）。
血浆样本在C1D1（给药前）、C1D15、C2D1及C3D1采集（每周期28天）。采用两种ctDNA检测方法：肿瘤依赖性F1T检测和肿瘤非依赖性F1LCDx检测。F1LCDx用于确定基线ctDNA肿瘤分数（cTF，ctDNA占血液中总游离DNA的比例）、BRAF V600突变状态，以及分析预先存在和治疗中出现的耐药改变。F1T用于纵向定量平均肿瘤分子数（MTM/mL）。由于F1T检测在试验期间停用，后续纵向分析改用F1LCDx。为弥补F1T数据缺失，研究人员利用F1T的MTM/mL与F1LCDx的cTF之间的高度相关性（R = 0.93；P值 = 1.5×10
-13）进行线性回归建模插补，构建了46例患者的完整纵向早期时间点数据集。ctDNA与临床因素及生存结局的关联采用Cox回归比例风险模型分析，通过最大对数秩统计量（maxstat）方法确定连续生物标志物的最佳截断值，并进行标志性分析以控制"不朽时间"偏倚。
临床疗效结果显示，BRAFi初治队列（n = 23）的客观缓解率（ORR）为26%，mPFS为9.6个月；而BRAFi经治队列（n = 26）ORR仅7.7%，mPFS为3.6个月，两组疗效差异显著。49例生物标志物可评估患者的中位年龄为60岁，男性24例，女性25例。两组的肝转移分布均衡（初治57% vs. 经治65%；P = 0.7326）。基线ctDNA水平（3.90% vs. 16%，Wilcoxon P = 0.2）和基线BRAF V600 VAF（3.53% vs. 15.85%，Wilcoxon P = 0.070）在初治与经治患者间虽无统计学差异，但呈现明显趋势，可能反映了经治患者更为侵袭性的生物学特征或更高的疾病负荷。重要的是，BRAFi初治患者在所有早期治疗时间点的ctDNA降低幅度均显著更深，且较经治患者获得更大治疗获益（Wilcoxon秩和检验P < 0.001）。
基线ctDNA水平与治疗反应相关，疾病进展（PD）患者的MTM/mL显著高于疾病稳定（SD）或部分缓解（PR）患者。低基线ctDNA是强预后因素：基于更大样本结直肠癌队列估计的预设截断值（≤10% cTF），低基线ctDNA患者PFS显著更长（mPFS = 284天 vs. 59天；HR = 0.32，P = 0.00051）。每增加一个logit单位的ctDNA，进展风险增加20%（HR = 1.2；P = 0.018）。多因素Cox回归显示，基线和C1D15 ctDNA水平、既往BRAFi治疗史及KRAS/NRAS状态是最具预后价值的因素。
早期ctDNA动态变化具有高度预测价值。在46例可进行纵向分析的患者中，治疗中ctDNA变化与PFS及RECIST 1.1标准高度相关。80.5%的SD和PR患者显示ctDNA降低>75%（分子应答），而PD患者中仅40%达到此标准。分子应答者的PFS显著延长（mPFS = 281天 vs. 43天，P < 0.0001）。该效应可能受既往BRAFi治疗史干扰：所有BRAFi初治患者均达到分子应答，而BRAFi经治患者中仅48%（12/25）达到。BRAFi初治PR患者的ctDNA动态显示持续深度降低（至少至C3D1），而经治PR患者则与SD患者演变模式相似。
对于SD患者，研究人员分析了基线ctDNA水平及C1D15变化以识别进展风险。桑基图显示，良好的ctDNA信号（基线≤10%且C1D15降低≥75%）可有效识别后续进展的患者，预测值为0.7。Cox回归模型中，SD风险类别的风险比（HR）为1.8至8.3。此外，完全ctDNA清除（100%降低）在C1D15罕见（仅6例），敏感性有限；>95%的降低阈值亦未能比75%阈值更好地区分PR与SD。
耐药机制分析方面，在37例基线cTF高于检测下限（LoD，>1%）的患者中，15例（40.5%）携带APC突变，11例（29.7%）携带ERK/MAPK通路基因突变；KRAS、NRAS和BRAF突变分别为21.6%、18.9%和13.5%。在17例停药或C9后cTF>LoD的患者中，MAPK通路和激活型BRAF突变比例升至58.8%和29.4%，而APC突变比例未增加。基线血浆中，BRAFi经治患者存在预先存在的MAPK通路耐药突变，而初治患者的此类突变仅在后续时间点或停药时检出。RAS突变在8例初治患者中4例出现，BRAF重排在3例患者中演变，其中2例伴随新发KRAS突变或扩增。这些获得性改变包括RAS突变及BRAF重排，后者可产生保留激酶结构域但缺失调控区的融合蛋白，导致组成性、RAS非依赖性的MAPK通路激活；BRAF激酶结构域重复则促进二聚化和持续的MAPK信号传导。
预先存在MAPK通路激活突变的患者基线ctDNA更高，PFS更短（KRAS/NRAS突变者mPFS = 56天 vs. 野生型223天）。Fisher检验显示KRAS/NRAS突变在经治患者中显著富集（P = 0.0041，R
2关联 = 30.1%），提示这与既往BRAFi治疗相关的潜在耐药机制。
Cox模型证实KRAS/NRAS突变状态是PFS最显著的负向预后因素（HR = 3.5，P = 0.003），支持这些共现突变绕过莫斯哌非尼单药抑制效应的观点。研究还评估了剂量强度对分子应答的影响，但未发现mosperafenib给药剂量与C1D15 ctDNA抑制深度之间存在显著关联，提示分子应答主要由肿瘤生物学驱动而非剂量分层。
该研究于《Cancer Research Communications》发表，其重要意义在于：首次系统验证了ctDNA作为莫斯哌非尼治疗BRAF V600突变mCRC的预后及预测性生物标志物，确立了早期ctDNA动态作为疗效终点的潜力，并通过纵向监测揭示了获得性耐药机制，为临床决策和试验设计提供了重要依据。
**关键技术方法**：本研究采用的主要关键技术方法包括：基于ISRCTN13713551注册的Ⅰ期临床试验设计，纳入BRAF V600突变mCRC患者队列（含BRAFi初治及经治患者）；纵向血浆样本采集（C1D1、C1D15、C2D1、C3D1）；肿瘤非依赖性F1LCDx检测（基于324基因panel的下一代测序，CAP/CLIA认证实验室）用于基线cTF定量、BRAF V600突变检测及耐药突变分析；肿瘤依赖性F1T检测（基于Signatera技术的多重PCR）用于MTM/mL纵向定量；线性回归模型插补法（F1T与F1LCDx相关性R = 0.93）构建完整纵向数据集；Cox回归比例风险模型及maxstat方法进行生存分析与最佳截断值确定；标志性分析控制偏倚。
**研究结果**：
**基线ctDNA作为mCRC的预后因素**：通过分析基线MTM/mL与RECIST 1.1缓解的关联，发现PD患者基线及早期治疗中ctDNA水平显著高于SD或PR患者。Kaplan-Meier分析证实低基线cTF（≤10%）预示显著更长的PFS（284天 vs. 59天；HR = 0.32，P = 0.00051）。进一步按既往BRAFi治疗状态分层显示，尽管治疗史影响生存，低基线ctDNA在两个子队列中均为有利预后信号。相关性矩阵分析确认了基线ctDNA与最佳总体缓解、分子应答及BRAF V600-mutant VAF的关联，并新发现KRAS/NRAS突变状态显著影响基线cTF（Wilcoxon P = 0.0085）。
**治疗中ctDNA动态与应答预测**：通过比较BRAFi初治与经治患者的对数转换MTM/mL及CFB，发现初治患者表现出显著更深、更持续的ctDNA降低。按最佳总体缓解分层显示SD和PR患者具有相似的治疗中动态模式。C1D15达到≥75% ctDNA降低（分子应答）的患者PFS显著延长（281天 vs. 43天，P < 0.0001），且该预测价值受治疗史调节。综合分层分析揭示了初治部分缓解者与经治进展者之间截然不同的分子模式。
**SD人群动态**：桑基图展示了31例C2D1影像评估为SD的患者流向，按既往BRAFi治疗状态、基线cTF（>10% vs. ≤10%）、C1D15分子应答（CFB ≥75% vs. <75%）及PFS分层。结果显示深度分子应答在所有BRAFi初治SD患者中实现，且通常与更长PFS相关。
**耐药机制**：Oncoprint图谱展示了基线和停药/进展时至少两例患者携带的突变基因景观，显示初治与经治患者之间突变获取模式的差异。最显著的是KRAS/NRAS和BRAF重排突变的获得。基线KRAS或NRAS突变 prevalence 在两组间存在显著差异（Fisher检验P = 0.0041），支持MAPK通路改变作为耐药机制的作用。
**讨论**：该转化研究调查了莫斯哌非尼单药治疗BRAF V600突变mCRC患者中基线ctDNA水平的预后价值及早期ctDNA动态的预测效能。研究结果确立了ctDNA作为该特定患者群体中高度信息化的实时生物标志物，用于患者分层和早期疗效评估。突变图谱分析则为该新型BRAF悖论突破抑制剂预先存在及获得性耐药机制提供了关键洞察。
莫斯哌非尼治疗产生了基于既往治疗史的明确差异化获益。BRAFi初治患者表现出显著更强的分子应答和更好的临床结局，mPFS明显更长，凸显了既往MAPK通路靶向药物暴露的关键影响。
基线cTF的预后价值突出：低基线ctDNA（cTF ≤10%）患者PFS更长，这一相关性强化了其他靶向治疗试验的观察——总体肿瘤负荷（以ctDNA反映）是临床结局的主要决定因素，与治疗药物无关。类似地，高基线BRAF V600-mutant VAF与更短PFS相关，与其作为原发肿瘤演化中主要、常为早期驱动突变的角色一致。
此外，早期ctDNA水平变化高度预测临床反应和PFS。C1D15时ctDNA大幅降低（≥75%）可识别PFS显著更长的患者，有效作为抗肿瘤活性的替代指标。尽管C1D15 ctDNA降低在单因素分析中是强预测因素，但其预后意义在多因素Cox模型中因纳入既往BRAFi治疗史而减弱，提示替代关系：有BRAFi暴露史的患者较难实现深度ctDNA降低。这些结果强调了治疗中ctDNA动态（C1D15 CFB）与既往BRAFi治疗史联合的预后价值。预测SD人群结局的努力凸显了早期ctDNA动态作为增加进展风险临床生物标志物的潜力，强调其在补充影像学评估和指导治疗干预中的效用。
SD与PR患者呈现相似的基线TF和治疗中动态模式，这一重叠凸显了ctDNA独立于肿瘤缩小检测药物活性的能力。标准RECIST 1.1标准常无法区分真正治疗敏感的SD患者与生长缓慢的耐药疾病。研究数据表明，≥75%的ctDNA降低可作为"活性"疾病控制的鉴别指标，有效识别出与部分缓解者获得相似持久生存获益的SD患者亚群。
初治与经治亚群之间的临床获益差异与基线MAPK通路改变景观密切相关。预先存在的耐药机制，特别是KRAS和NRAS突变以及BRAF重排/扩增，在BRAFi经治患者基线中显著富集，这与临床前患者来源异种移植（PDX）模型的观察一致。Cox模型证实KRAS/NRAS突变状态（HR = 3.5，P = 0.003）是PFS最显著的负向预后因素，支持这些共现突变绕过莫斯哌非尼单药抑制效应的观点。
纵向分析进一步阐明了初治患者的获得性耐药过程。虽然该初治队列最初表现出深度分子应答，但RAS突变在4例患者治疗中或停药时出现，BRAF重排在3例患者中演变，其中2例伴随新发KRAS突变或扩增。这些获得性改变代表了明确的耐药机制，与靶向治疗施加的选择压力预期一致。获得性BRAF重排可产生保留激酶结构域但缺失调控区的融合蛋白，导致组成性、RAS非依赖性的MAPK通路激活；BRAF激酶结构域重复则促进二聚化并维持MAPK信号传导。两种机制均恢复通路活性以逃逸莫斯哌非尼的抑制效应，驱动肿瘤持续生长。ctDNA的动态监测能力促进了实时肿瘤基因分型和逃逸机制识别，凸显了联合或下一代治疗策略的必要性。
研究存在Ⅰ期设计固有的局限性，包括样本量小和队列异质性。为应对F1T检测停用后的数据不完整，研究人员利用MTM/mL与cTF的高度相关性进行数据插补。虽然该方法实现了更完整的纵向分析，但联合肿瘤依赖性（F1T）和肿瘤非依赖性（F1LCDx）检测引入了可能影响预测与观察ctDNA趋势可靠性的分析复杂性。这一局限性凸显了临床实施中的更广泛挑战：ctDNA检测技术的快速演进。尽管标准化和验证方案至关重要，但无法消除肿瘤依赖性与肿瘤非依赖性方法间的根本差异。可能需要建立类似本研究的基于相关性的比较验证框架，记录和量化检测间差异，使临床医生不仅理解单个检测性能，还了解发现如何跨平台转化。此外，单时间点虽是强反应预测因子，但可能无法捕获快速逃逸新治疗压力的耐药亚克隆肿瘤，正如个体患者的ctDNA轨迹所示。
除技术考量外，研究人群的临床和分子异质性也是局限，包括有意纳入BRAFi初治和经治两个队列。由于临床史与基线共现KRAS/NRAS突变的 prevalence 直接相关，既往治疗经验与分子耐药状态之间的这一共线性需谨慎解读多因素Cox模型。这种复杂混杂凸显了更大规模Ⅱ期研究的必要性，以分层既往MAPK通路抑制史，从而更清晰地评估早期ctDNA动态等预测性生物标志物，独立于预先存在的耐药。
**研究结论**：该研究表明ctDNA是BRAF V600突变mCRC患者群体中的强大非侵入性生物标志物。基线ctDNA水平可有效分层患者，C1D15早期的75% ctDNA降低高度预测有利临床结局。关键的是，纵向ctDNA监测提供了耐药演变的实时证据，将获得性RAS和BRAF改变与疾病进展相关联。这些发现有力支持将早期ctDNA动态整合为莫斯哌非尼及类似药物未来临床试验的疗效终点，可能加速决策制定或为BRAF V600突变mCRC患者及时启用替代治疗方案。
