转录组学分析揭示了挥发性抑菌化合物3-乙基苯甲醛对橄榄假壳菌的生长抑制机制

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Transcriptomics analysis elucidates the growth inhibitory mechanisms of volatile fungistatic compound 3-ethylbenzaldehyde to Pseudocryphonectria elaeocarpicola

　　杨玉辰|冉桂玲|吴浩宇|李良基|熊殿光|黄华毅|田成明
中国北京林业大学森林资源高效生产国家重点实验室，北京100083

摘要
假尾孢属真菌是一种具有高度破坏性的植物病原菌，可引发乌桕茎枯病，给城市绿化系统带来严重的经济损失和生态危害。先前的研究表明，挥发性有机化合物3-乙基苯甲醛对这种真菌具有显著的抑制作用。仅需极低浓度的3-乙基苯甲醛（3.724 μg/mL）即可实现100%的菌丝生长抑制率。为阐明该挥发性有机化合物的抗真菌机制，我们对用1倍浓度（0.931 μg/mL）和2倍浓度（1.862 μg/mL）的3-乙基苯甲醛处理的假尾孢属真菌进行了比较转录组分析。研究结果表明，3-乙基苯甲醛具有典型的浓度依赖性抗真菌活性。功能富集分析显示，淀粉和蔗糖代谢以及糖酵解/糖异生等核心碳代谢途径在该化合物的作用机制中起关键作用。DNA复制途径则表现出独特的浓度响应模式，在假尾孢属真菌抵御3-乙基苯甲醛的防御过程中起着至关重要的作用。其中，有五个参与上述过程的关键调控基因被选为3-乙基苯甲醛的潜在靶标，通过外源dsRNA处理验证了这些基因确实与真菌生长相关。本研究揭示了3-乙基苯甲醛通过抑制包括核心碳代谢和DNA复制在内的多条途径来阻止假尾孢属真菌生长的分子机制，为其在开发针对乌桕茎枯病的新型高效防治剂方面提供了重要依据。

引言
假尾孢属真菌是一种具有重大经济和生态意义的植物病原菌，也是导致乌桕属植物茎枯病的主要致病因子。该真菌会严重抑制乌桕属植物的生长发育，导致其生产力大幅下降且生命周期缩短。在中国广东省，这种病原菌对当地乌桕属植物的栽培管理以及城市景观绿化项目构成了巨大威胁（Huang等人，2022）。假尾孢属真菌具有典型的致病特征：它主要感染寄主植物的树干和侧枝，早期感染会在树皮表面出现明显的灼烧状症状；在感染后期，受感染的树皮上会长出大量橙黄色的菌丝体。现有研究表明，该真菌具有极强的致病性，能显著缩短受感染树木的存活时间，大多数受感染植株在感染后五个月内就会死亡（Huang等人，2022）。鉴于假尾孢属真菌造成的严重危害，亟需开发有效的控制策略，而研发具有强效抗真菌作用的化合物已成为重要的研究方向。

3-乙基苯甲醛（m-乙基苯甲醛，C9H10O）是一种从黑曲霉XW2的抗菌挥发成分中分离得到的挥发性有机化合物，已被证明具有作为高效抗真菌剂对抗乌桕茎枯病真菌及其他多种植物病原真菌的巨大潜力（Huang等人，2015）。研究表明，该化合物能够完全抑制多种病原真菌的生长，包括胶孢炭疽菌、金黄壳二孢菌、禾谷镰刀菌、大丽轮枝菌等（图1A）。值得注意的是，3-乙基苯甲醛可能是白粉菌被丛梗孢菌有效抑制的关键因素之一（Di Francesco等人，2020）。

目前关于3-乙基苯甲醛抗真菌作用分子机制的研究仍然有限。不过，已有研究对其结构类似物——苯甲醛（BAld，C7H6O）和肉桂醛（CA，C9H8O）的抗真菌机制进行了探讨。苯甲醛是植物体内分布最广泛的挥发性有机化合物之一，它在调节植物风味和防御机制中起着关键作用（Jiang等人，2024）。例如，采收后的番茄释放的苯甲醛可通过挥发物使灰葡萄孢菌中的BcGPR3蛋白失活，从而阻止该蛋白向cAMP信号通路传递信号，进而抑制灰葡萄孢菌的生长和致病性（Lin等人，2019）。肉桂醛是一种具有双重药用和抗菌特性的天然植物化学物质，已被证明能够显著抑制灰葡萄孢菌的孢子萌发和菌丝生长。其作用机制包括特异性靶向真菌类固醇14α-脱甲基酶（CYP51），从而导致菌丝崩溃和结构解体，引发活性氧积累，进而导致脂质过氧化和细胞渗漏；同时还会促进菌丝内甘油的积累，可能引起渗透压胁迫。此外，肉桂醛还能通过诱导孢子内活性氧积累和细胞死亡来有效抑制孢子形成和萌发（Wang等人，2025；Yang等人，2023）。这些研究表明，苯甲醛和肉桂醛都是通过复杂的多靶点机制发挥抗真菌作用的。在此基础之上，随着组学技术的进步，基于高通量测序的转录组分析已成为系统解析自然界中各种结构各异的抗真菌化合物分子机制的强大工具。例如，对亚洲镰刀菌中phenamacril作用效果的转录组分析（Zheng等人，2024）、对禾谷镰刀菌经多菌灵、phenamacril、吡唑醚菌酯和戊唑醇处理后的比较转录组分析（Guo等人，2024；Liu等人，2010），以及对烟草霜霉病菌经80 μg/mL百里酚处理后的基因转录谱分析（Zhang等人，2018）都一致显示出化合物处理后真菌基因表达的整体变化。针对禾谷镰刀菌对四种不同抗真菌化合物反应机制的研究表明，所有测试的化合物均能显著抑制菌丝生长；碳水化合物代谢（如糖酵解/糖异生）和氨基酸代谢等关键代谢途径被确定为真菌对这类化合物反应的核心环节（Guo等人，2024）。同样，阿育王芽孢杆菌释放的挥发性有机化合物也对扩展青霉具有抑制作用。转录组分析显示，其主要挥发性成分2-壬醇能够调控扩展青霉中与菌丝生长、分生孢子形成以及次生代谢产物合成相关的基因表达，包括类固醇生物合成、柠檬苦素和展青霉素的生成（Song等人，2024）。总体而言，这些研究都表明转录组分析是阐明抗真菌化合物分子机制的有效手段。

碳水化合物代谢途径和DNA复制途径在真菌的生长发育及环境适应中起着核心作用。碳水化合物代谢途径通过能量供应和应激适应等多个方面调控真菌的发育过程（Ceccaroli等人，2011；Fountain等人，2019）。DNA复制途径则有助于维持基因组的稳定性（Van Der Horst等人，2025）。在黄曲霉中，碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢和多胺代谢在氧化应激反应中起着关键作用（Fountain等人，2019）。丛枝菌根真菌通过调控糖酵解和氨基酸代谢途径，增强盐生草在镉和氯化钠联合胁迫下的耐受能力，从而优化资源分配以应对胁迫。此外，外生菌根真菌中碳水化合物代谢的核心调控作用与其高效吸收和利用光合作用产生的碳物质，尤其是蔗糖的独特生理能力密切相关（Ceccaroli等人，2011）。

在本研究中，我们对用1倍浓度和2倍浓度3-乙基苯甲醛处理的假尾孢属真菌的转录组数据进行了比较分析，系统阐明了该挥发性有机化合物针对该真菌的抗真菌机制。研究重点分析了关键代谢途径和调控网络中差异表达基因的分布特征，尤其关注了碳水化合物代谢途径和DNA复制途径的富集情况。更重要的是，研究还鉴定并表征了一系列与生长调控相关的关键基因。这些结果不仅系统地阐明了3-乙基苯甲醛的分子抗真菌机制及其多途径作用机制，还为后续针对乌桕属植物茎枯病的预防和控制策略提供了重要的分子理论依据。

片段摘录
菌株、培养基与挥发性物质
本研究所使用的假尾孢属真菌菌株最初是从乌桕树患病树皮中分离得到的（样本采集流程符合当地相关规定），该菌株已保存在中国林业文化收藏中心（CFCC，http://cfcc.caf.ac.cn/）。实验前，将假尾孢属真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于25℃下培养备用。实验用3-乙基苯甲醛为技术级产品，纯度为95%，化学文摘号为34246-54-3，由北京新恒岩科技有限公司提供。

3-乙基苯甲醛对菌丝生长的抑制作用
我们通过菌丝生长速率测定法研究了假尾孢属真菌对3-乙基苯甲醛的敏感性（图1A）。实验中，我们用五种不同梯度的3-乙基苯甲醛处理该真菌（1×-5×，0.931–4.655 μg/mL），并在处理3天后观察菌落生长情况（图1B）。如图1C、D所示，3-乙基苯甲醛确实能抑制假尾孢属真菌的菌丝生长。该真菌对3-乙基苯甲醛的EC50值为0.71 μg/mL，最大抑制率为100%。

讨论
乌桕属植物茎枯病是一种新近发现的植物疾病，由其高毒力的假尾孢属真菌引起，会给生态系统和农业经济带来严重威胁。高通量测序技术的不断进步使得假尾孢属真菌基因组的测序和优化工作得以顺利进行，为阐明其致病分子机制奠定了重要基础。然而，目前仍缺乏有效的控制技术……

结论
本研究通过对比分析用1倍浓度（0.931 μg/mL）和2倍浓度（1.862 μg/mL）3-乙基苯甲醛处理的假尾孢属真菌的转录组，研究了该化合物的抗真菌机制及关键靶标。差异表达基因的功能注释和动态聚类分析表明，碳水化合物代谢和DNA复制是3-乙基苯甲醛在假尾孢属真菌中干扰的关键途径。

作者贡献声明
杨玉辰：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化分析，验证，方法设计，研究实施。
冉桂玲：实验材料准备，方法设计，研究实施。
吴浩宇：实验材料准备，方法设计，研究实施。
李良基：方法设计，研究实施。
熊殿光：写作——审阅与编辑，研究指导，方法设计，概念构思。
黄华毅：写作——审阅与编辑，研究指导，资金获取，概念构思。
田成明：写作——审阅与编辑。

利益冲突声明
作者声明不存在任何利益冲突。

致谢
本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515013280）的支持。