《Pharmacological Research》：Circulating ATP from hepatic ischemia-reperfusion drives remote cardiac injury via macrophage inflammasome activation
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肝切除术后心脏并发症频发，但肝缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury, HIRI)如何损伤远程心脏尚不清楚。在382例肝切除患者中，术后心肌损伤发生率随肝损伤严重程度加重从20.5%升至50%(P < 0.000
肝切除术后心脏并发症频发，但肝缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury, HIRI)如何损伤远程心脏尚不清楚。在382例肝切除患者中，术后心肌损伤发生率随肝损伤严重程度加重从20.5%升至50%(P < 0.0001)。在小鼠HIRI模型中，心功能障碍滞后于肝损伤；循环ATP在再灌注后1小时内从缺血肝脏激增，且对驱动远程心脏损伤既充分又必要。细胞外ATP激活心脏巨噬细胞上的P2X7受体(Purinergic Receptor P2X7, P2X7R)，触发NLRP3(NOD-like Receptor Family Pyrin Domain Containing 3)炎症小体组装和gasdermin D(GSDMD)依赖性心肌细胞焦亡(cardiomyocyte pyroptosis)；基于siRNA的优势门控共培养实验鉴定巨噬细胞P2X7为上游门控步骤，而心肌细胞侧P2X7敲除未能消除下游焦亡。单细胞测序追踪该程序至单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages, MoMF)分化为炎性巨噬细胞的轨迹，且巨噬细胞在体外将肝细胞来源的ATP放大为IL-1β驱动的心肌细胞焦亡。氯膦酸盐介导的巨噬细胞清除可保护心脏功能。选择性P2X7拮抗剂JNJ-47965567使心脏巨噬细胞向抗炎表型极化，并在再灌注开始后约3小时内给药时抑制NLRP3-GSDMD焦亡，确定了临床相关的治疗窗。腺苷激活A2A受体并剂量依赖性地减轻心脏损伤，该效应可被SCH-58261逆转，且比地塞米松(dexamethasone)或N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)提供更大的心脏保护作用。这些发现确立心脏巨噬细胞为肝脏来源危险信号的放大器，并将ATP-P2X7/腺苷-A2A嘌呤能轴(ATP-P2X7/adenosine-A2A purinergic axis)识别为围术期心脏保护的潜在药理学靶点。
## 一、研究背景与问题
心血管并发症是肝移植和重大肝切除术后早期死亡的主要原因。肝缺血再灌注损伤(HIRI)作为血管夹闭不可避免的后果，会触发延伸至远处器官的无菌性炎症反应。接受肝切除的患者面临比其它腹部手术更高的心肌损伤风险(MINS)。与肺和肾不同，成年心肌细胞几乎丧失增殖能力，这使得心脏对无法通过再生补偿的炎性细胞损失特别脆弱。然而，连接肝缺血再灌注与心脏损伤的分子通路尚未被鉴定。
无菌性炎症由损伤相关分子-分子模式(DAMPs)启动，其中细胞外ATP可作为急性器官间危险信号。细胞内ATP浓度超过细胞外数千倍；在缺血再灌注期间，膜完整性破坏使这一梯度崩溃，将ATP释放到循环中。由于外切核苷酸酶(ectonucleotidases)可快速将ATP降解为腺苷，这种脉冲式细胞外特征适合启动急性远程反应而非维持反应。
P2X7受体(P2X7R)具有极高激活阈值，仅在组织损伤释放的高水平ATP作用下开放，可将病理性ATP升高转化为细胞内炎症信号，驱动钾离子外流、NLRP3炎症小体组装、IL-1β成熟及GSDMD介导的细胞焦亡。心脏中，巨噬细胞支配局部炎症反应，包含两个主要亚群：胚胎来源的常驻巨噬细胞(Timd4?Lyve1?)和CCR2?单核细胞来源的巨噬细胞(MoMF)。CCR2? MoMF在稳态心脏中已构成相当数量，使其处于循环与心肌之间的界面位置。但当前对心脏巨噬细胞炎症功能的认知几乎完全来源于心肌梗死等局部损伤模型；来自远处器官的循环炎症信号能否激活心脏巨噬细胞、哪个亚群响应、以及该响应是否与局部损伤中的响应相似，尚未被验证。
作为生理学上的制衡机制，ATP代谢产物腺苷通过A2A受体发挥抗炎和心脏保护作用。CD39和CD73将细胞外ATP顺序水解为腺苷，形成ATP通过P2X7激活炎症而腺苷通过A2A抑制炎症的调控轴。在心脏缺血再灌注模型中，A2A受体激活可减小梗死面积并保护心室功能。因此，ATP-腺苷平衡可能决定远程心脏损伤的进展或消退。
基于上述背景，研究人员整合382例肝切除患者的临床队列和小鼠HIRI模型，验证来自缺血肝脏的循环ATP是否通过心脏巨噬细胞激活驱动远程心脏损伤，并探究ATP-P2X7/腺苷-A2A嘌呤能轴作为围术期心脏保护药理学靶点的潜力。
## 二、研究方法概述
研究采用了临床回顾性队列分析与动物实验相结合的策略。临床部分收集北京清华长庚医院2016年3月至2022年4月期间382例择期肝切除患者，通过术后丙氨酸氨基转移酶(ALT)分层分析MINS发生率及危险因素。动物实验采用C57BL/6J雄性小鼠70%部分肝脏缺血60分钟模型，通过超声心动图、组织病理学、ELISA及蛋白质印迹评估心脏功能与损伤；利用荧光素-荧光素酶生物发光法动态监测血浆ATP，通过静脉注射外源性ATP及apyrase酶促清除验证ATP的充分性与必要性。采用10x Genomics单细胞RNA测序解析心脏免疫景观，Monocle2进行拟时序轨迹分析。建立三步体外共培养系统（HepG2肝细胞缺氧/复氧→与RAW264.7巨噬细胞Transwell共培养→巨噬细胞条件培养基作用于AC16心肌细胞），结合siRNA介导的优势门控分析定位P2X7的功能节点。药物干预包括P2X7拮抗剂JNJ-47965567、A2A激动剂腺苷及其拮抗剂SCH-58261、地塞米松和N-乙酰半胱氨酸等，通过延迟给药确定治疗窗口。
## 三、研究结果
**肝缺血再灌注诱导远程心功能障碍**：临床队列中，382例肝切除患者按术后峰值ALT分为三层（<3×ULN、3-10×ULN、>10×ULN），MINS发生率呈梯度上升（20.5%、30.8%、50.0%，P<0.0001），调整后T3与T1比值比为2.46（95%CI 1.12-5.38），ALT峰值与高敏心肌肌钙蛋白T变化量呈正相关。小鼠HIRI后，肝脏IL-1β绝对增幅最高，心脏在肝外器官中升高最显著；组织学显示心肌纤维紊乱和炎性细胞浸润，超声心动图示左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS)从6小时起下降、12小时达谷值，心肌损伤评分同步升高。关键时序特征为ALT/AST峰值出现在6小时而心肌肌钙蛋白I(cTnI)持续上升至12小时，表明肝损伤先于并驱动后续心脏损伤。
**缺血肝脏来源的循环ATP足以导致远程心脏损伤**：血浆ATP在再灌注后1小时即达峰值，早于HSP90(6小时)和HMGB1(9小时)；组织ATP含量仅在肝脏降低，门静脉至下腔静脉至左心室存在递减浓度梯度，且随着缺血时间延长血浆ATP与cTnI呈强相关(Spearman ρ=0.91)。静脉注射外源性ATP可再现HIRI样心功能障碍（cTnI升高、LVEF/LVFS下降、组织学损伤），满足充分性标准。
**ATP耗竭和腺苷保护HIRI后的心脏**：Apyrase预处理降低血浆ATP并恢复LVEF，ALT/AST仍有轻度升高但心脏优先受益，满足必要性标准。腺苷、地塞米松和NAC均改善LVEF，以腺苷效果最大；腺苷剂量依赖性降低cTnI并提高LVEF，10mg/kg达平台期。分子对接证实ATP与P2X7、腺苷与A2A受体的稳定结合。
**MoMF分化为P2X7富集的炎性巨噬细胞**：单细胞测序识别9群免疫细胞，稳态心脏中MoMF占26.3%，炎性巨噬细胞几乎缺如(0.2%)；HIRI后炎性巨噬细胞跃升至27.6%，MoMF降至11.2%。沿MoMF至炎性巨噬细胞拟时序轨迹，Ccr2和Ly6c2渐进下降而P2rx7、Nlrp3和Il1b协同上升，Gsdmd保持稳定，表明HIRI驱动现存MoMF原位状态转变而非急性外周招募。
**P2X7驱动巨噬细胞极化和心脏损伤**：免疫荧光显示HIRI心脏F4/80?巨噬细胞中P2X7?比例显著升高；JNJ-47965567降低血浆cTnI和心脏IL-1β，减少iNOS?巨噬细胞并增加CD206?巨噬细胞。氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞保护LVEF和LVFS，证实巨噬细胞为必要效应细胞。
**HIRI激活心脏NLRP3-GSDMD焦亡**：批量RNA测序显示HIRI后炎症小体和焦亡相关转录本广泛上调，GSEA证实REACTOME_PYRPTOSIS正富集。蛋白质水平NLRP3、剪切型caspase-1/pro-caspase-1比值、GSDMD-N/GSDMD-FL比值均升高，主要定位于F4/80?巨噬细胞。Apyrase降低上述标志物，BzATP逆转保护；JNJ-47965567和腺苷均抑制焦亡蛋白，SCH-58261阻断腺苷的保护作用。GSDMD-N与心肌肌钙蛋白T(cTnT)共定位于心肌细胞，HIRI后达40%；腺苷降至10%，SCH-58261逆转至30%。TUNEL?/cTnT?细胞比例极低，提示损伤以焦亡而非凋亡为主。
**P2X7拮抗剂界定治疗窗口**：JNJ-47965567在再灌注后30分钟、1小时、3小时给药均保留心功能保护，6小时给药失效，确定约3小时治疗窗。延迟腺苷给药在各时间点均有保护作用，提示可能保留更长有效窗口。
**巨噬细胞放大ATP信号驱动心肌细胞焦亡**：三步共培养系统中，HepG2缺氧/复氧后上清ATP升高且可被apyrase清除；RAW264.7巨噬细胞表达P2X7上调，Nos2 mRNA和IL-1β分泌最高，JNJ-47965567独立抑制，BzATP逆转apyrase效应。Mac-CM诱导AC16心肌细胞LDH释放和GSDMD-N积累，H/R HepG2-CM直接作用效果较弱，证实巨噬细胞的信号放大作用。
**巨噬细胞P2X7门控心肌细胞焦亡**：siP2rx7-RAW使PI?膜通透性从40.1%降至10.1%，并消除NLRP3和IL-1β剪切；siP2RX7-AC16对巨噬细胞侧读数无影响。在心肌细胞侧，siP2rx7-RAW而非siP2RX7-AC16 abolished GSDMD-N荧光和C-CASP1/GSDMD-N蛋白，确立巨噬细胞P2X7为上游必要门控步骤。
## 四、讨论与结论
本研究鉴定了连接肝缺血再灌注与远程心脏损伤的信号通路：循环ATP从肝脏释放，通过P2X7受体激活心脏巨噬细胞中的NLRP3炎症小体，最终驱动心肌细胞焦亡。在这一"肝-巨噬细胞-心脏"级联中，心脏巨噬细胞将肝来源的危险信号转换并放大为局部心肌损伤。
研究人员将细胞外ATP确定为连接肝损伤与远程心脏损伤的起始介质。三种循环DAMPs中，ATP在再灌注后1小时内即达峰值，远早于HSP90和HMGB1，其时空特征与缺血细胞通过膜破裂和pannexin通道快速释放ATP的已知机制相符。静脉ATP梯度、肝组织ATP耗竭及apyrase保护共同指向缺血肝脏为循环ATP来源。各器官中，心脏表现出血清IL-1β最显著升高，但GSDMD介导的焦亡激活以心脏为主、肺肾脑较小，反映不同器官驻留巨噬细胞的差异性炎症准备状态。
单细胞数据揭示了心脏巨噬细胞在远程肝损伤后的炎症重编程。稳态MoMF已表达P2rx7和Pycard，携带炎症小体激活的分子底物；拟时序分析显示P2rx7诱导先于Nlrp3和Il1b，契合炎症小体激活的双信号模型。这种预装载配置为心脏成为循环ATP的主要靶器官提供了最简洁解释。需要强调的是，MoMF的长期心脏驻留表明其炎症转化是循环ATP对现存局部免疫细胞的原位激活，而非急性外周招募。
巨噬细胞不仅是响应者，更是肝危险信号的放大器。体外系统中，肝细胞条件培养基直接作用心肌细胞仅引起轻度损伤，而经巨噬细胞转导后细胞毒性和GSDMD-N积累显著增加。优势门控分析精确定位巨噬细胞P2X7为必要上游门控，心肌细胞P2X7在该系统中为可替代节点。
腺苷-A2A受体途径构成对抗ATP-P2X7损伤的内源性保护机制。JNJ-47965567使心脏巨噬细胞从iNOS?促炎向CD206?抗炎表型极化；腺苷通过A2A受体抑制NLRP3-GSDMD焦亡，其保护作用具有受体饱和动力学特征。P2X7拮抗剂保留约3小时治疗窗，与当前围术期监测方案兼容；腺苷作为临床已建立的心血管药物，提供互补的嘌呤能干预策略。
**研究结论**：本研究将肝缺血再灌注来源的循环ATP鉴定为远程心脏损伤的起始介质，并将ATP-P2X7/腺苷-A2A嘌呤能轴确定为围术期心脏保护的临床相关靶点。心脏MoMF来源的炎性巨噬细胞作为放大节点，将循环危险信号转化为局部焦亡损伤。P2X7拮抗在再灌注开始后约3小时的治疗窗内保留疗效，支持其在重大肝切除或肝移植患者中的前瞻性评估。
