《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide analysis of the LAR gene family and the role of OvLAR71 in proanthocyanidin biosynthesis in Onobrychis viciifolia
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百脉根(Onobrychis viciifolia Scop.)是一种富含原花色素(Proanthocyanidins, PAs，又称缩合单宁Condensed Tannins, CTs)的多年生豆科牧草。PAs作为重要的植物次生代谢产物，不仅参与植物抗逆防御
百脉根(Onobrychis viciifolia Scop.)是一种富含原花色素(Proanthocyanidins, PAs，又称缩合单宁Condensed Tannins, CTs)的多年生豆科牧草。PAs作为重要的植物次生代谢产物，不仅参与植物抗逆防御，还能显著改善牧草品质。无色花色素还原酶(Leucoanthocyanidin Reductase, LAR)是PAs生物合成与积累的关键酶，但目前关于百脉根中LAR基因家族的系统研究较为匮乏。研究人员对百脉根基因组进行了LAR(OvLAR)基因家族的全基因组鉴定与系统解析，共鉴定出83个OvLAR基因，其不均匀分布于28条染色体上。系统发育分析将83个OvLAR蛋白划分为5个进化分支，片段重复(Segmental Duplication)是OvLAR基因家族扩张的主要驱动力。顺式作用元件分析表明OvLAR基因的表达可能受内源信号与环境信号的双重调控，提示其参与协调次生代谢与适应性发育的复杂调控网络。qRT-PCR结果显示OvLAR基因存在组织特异性表达模式，且对不同非生物胁迫表现出差异转录响应。功能实验进一步证实，在烟草(Nicotiana tabacum)和百脉根中过表达OvLAR71可显著促进叶和花中PA的生物合成与积累，并伴随明显的花色变化。综上，本研究首次全面揭示了百脉根LAR基因家族的特征，阐明了其在PA生物合成中的作用，为牧草品质遗传改良奠定了理论基础。
论文解读：《Genome-wide analysis of the LAR gene family and the role of OvLAR71 in proanthocyanidin biosynthesis in Onobrychis viciifolia》（发表于Plant Physiology and Biochemistry）
原花色素(Proanthocyanidins, PAs，又称缩合单宁Condensed Tannins, CTs)是由黄烷-3-醇单元聚合形成的多酚类次生代谢产物，在植物中可增强对非生物和生物胁迫的抗性，在畜牧业中能通过形成CT-蛋白复合物提高反刍动物蛋白质利用率、防止臌胀病并减少甲烷排放。百脉根(Onobrychis viciifolia Scop.)作为重要豆科牧草，叶片PA含量高达80 g/kg，远高于紫花苜蓿。PA合成途径中，无色花色素还原酶(Leucoanthocyanidin Reductase, LAR)催化无色花色素(Leucoanthocyanidin)生成(+)-儿茶素((+)-catechin)，与花色素还原酶(Anthocyanidin Reductase, ANR)共同决定PA单体组成。拟南芥(Arabidopsis thaliana)缺乏LAR同源基因，PA主要通过ANR依赖途径合成；而豆科植物通常含有LAR。目前百脉根LAR基因家族的全基因组鉴定、进化机制及功能研究尚属空白，限制了对其高PA积累分子机理的理解及牧草品质改良。为此，研究人员以四倍体百脉根基因组为材料，开展OvLAR基因家族全基因组鉴定、生物信息学分析及OvLAR71功能验证。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：基于Pfam数据库PF01370结构域利用HMMER及BLASTP从百脉根基因组中鉴定LAR基因家族成员；利用ClustalW多重序列比对及MEGA11邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建百脉根、紫花苜蓿(Medicago sativa)和大豆(Glycine max)LAR蛋白系统发育树；使用MCScanX进行基因组共线性与基因复制事件分析并计算非同义替换率(Ka)/同义替换率(Ks)；利用PlantCARE预测启动子顺式作用元件；基于公共转录组数据与qRT-PCR分析组织特异性及MeJA、NaCl、ABA、SA处理下的表达模式；通过农杆菌介导的瞬时转化观察OvLAR16/OvLAR21/OvLAR71亚细胞定位；构建pCAMBIA1300过表达载体遗传转化本氏烟(Nicotiana benthamiana)/栽培烟草(Nicotiana tabacum)及百脉根本体获得过表达株系；采用DMACA法测定PA含量、分光光度法测定花青素(Anthocyanin)含量及qRT-PCR检测黄酮类途径结构基因表达。
3.1. Identification and classification of the OvLAR gene family
研究人员在百脉根基因组中鉴定出83个OvLAR基因(OvLAR1–OvLAR83)，氨基酸长度99–562 aa，分子量10.511–62.597 kDa，等电点(pI)4.84–9.1，多数呈酸性、亲水性，预测定位于细胞质，二级结构含α螺旋、β折叠和无规卷曲。
3.2. Phylogenetic analysis
将百脉根(83个)、紫花苜蓿(54个)和大豆(153个)共290个LAR蛋白构建NJ树，聚为5个分支(Clade I–V)。同一分支内含不同物种LAR，表明进化保守性；Clade II、IV、V含较多OvLAR，暗示基因重复与功能分化。
3.3. Chromosome localization and colinearity analysis
83个OvLAR不均匀分布于28条染色体，chr02b含最多(8个)，10条染色体仅含1个。共线性分析发现111对共线基因对(74对同源染色体间，37对非同源染色体间)，片段重复是家族扩张主因。Ka/Ks计算显示约80%基因对Ka/Ks < 1，受纯化选择(Purifying Selection)；1对Ka/Ks > 1提示正选择。种间共线性显示百脉根与紫花苜蓿(201对)、大豆(135对)共线性高，与水稻(11对)低，说明豆科LAR基因家族高度保守。
3.4. Cis-acting element analysis of OvLAR genes
启动子区分析鉴定出光响应、激素响应(MeJA-响应CGTCA/TGACG-motif、ABA-响应ABRE、SA-响应TCA-element、GA-响应TATC-box、Auxin-响应TGA-element)、环境响应(低温LTR、厌氧ARE)及发育相关(TC-rich repeats、Circadian)元件，表明OvLAR受多信号调控参与生长发育与胁迫适应。
3.5. Analysis of OvLAR gene expression patterns
qRT-PCR显示OvLAR具组织特异性：种子和叶PA含量高，OvLAR4、OvLAR16等种子高表达；OvLAR71花期高表达。MeJA处理上调OvLAR16/29/31，下调OvLAR33/72；NaCl处理显著诱导OvLAR4(约70倍)、OvLAR31、OvLAR71；ABA诱导OvLAR72；SA无一致趋势。转录组显示高PA品系中OvLAR71表达高于低PA品系，盐旱胁迫下OvLAR35先抑后升，OvLAR43先降后升，OvLAR71持续高表达，提示其与PA积累及抗逆相关。
3.6. Subcellular localization of OvLARs
瞬时表达显示OvLAR16、OvLAR21和OvLAR71融合GFP蛋白均定位于细胞质，与预测一致。
3.7. Effect of OvLAR71 Overexpression on Proanthocyanidin Biosynthesis and Flower Color
烟草中过表达OvLAR71使叶PA含量显著升高(最高约375 μg/g)，花冠花青素含量增加约3倍，花冠管伸长、加宽、开口变窄、着色加深。叶中黄酮途径基因(NtCHS、NtCHI等)多被抑制，仅NtF3'H上调；花中NtCHS、NtCHI、NtDFR、NtANS、NtUFGT上调。百脉根过表达株系DMACA染色及定量均证实PA积累显著增加，OvANR、OvDFR、OvANS、OvUFGT表达下调，OvF3'H相对高表达。
讨论与结论总结
讨论指出四倍体百脉根OvLAR家族扩张主要由片段重复驱动，受纯化选择维持功能保守，启动子富集激素与胁迫响应元件与其表达模式吻合。OvLAR71在花和胁迫下高表达，过表达促进PA及花青素积累并影响花形态，体现组织特异性调控及与黄酮途径的交互。今后需结合CRISPR/Cas9敲除及体外酶活性实验深入解析。
结论翻译：本研究报道了百脉根LAR基因家族的全基因组鉴定与系统解析，包括理化性质、系统发育关系、染色体定位、共线性和启动子顺式作用元件。四倍体百脉根中OvLAR基因家族主要通过片段重复发生扩张，该家族经历了功能分化，呈现明显的组织特异性表达并被多种激素和非生物胁迫显著诱导。此外，研究人员初步证实OvLAR71正向调控PA积累。这些发现为阐明百脉根PA生物合成分子机制奠定基础，也为通过基因工程靶向调控PA生物合成改良牧草品质提供了参考。
