整合网络药理学与体内评价揭示菊苣（Cichorium intybus L.）提取物通过激活自噬缓解蛋鸡脂肪肝出血综合征

《Poultry Science》：Integrating network pharmacology and in vivo evaluation reveals chicory (Cichorium intybus L.) extract activates autophagy to alleviate fatty liver hemorrhagic syndrome in laying hens

　　

本研究旨在探究菊苣（Cichorium intybus L.）根乙醇提取物（CEE）对高能低蛋白（HELP）饲粮诱导的蛋鸡脂肪肝出血综合征（FLHS）的药理作用及其机制。采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术对CEE进行成分分析，结合网络药理学方法，共鉴定出三种生物活性成分：山莴苣苦素（lactucopicrin）、2S,2′S-橙黄酰胺乙酸酯（2S,2′S-Aurantiamide acetate）和木犀草素（luteolin）。试验选用72只50周龄的海兰褐蛋鸡，随机分为三组，每组4个重复，每个重复6只。阴性对照（NC）组饲喂标准基础饲粮，另外两组分别饲喂添加0 g/kg或15 g/kg CEE的HELP饲粮，分别记为FLHS组和CEE组。预试期为1周，正试期为12周。结果表明，HELP饲粮显著增加了蛋鸡体增重，而CEE组在试验第12周时体增重较FLHS组显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。CEE添加显著恢复了产蛋率，并降低了料蛋比（P < 0.01）。FLHS组蛋鸡表现出明显的肝脂肪变性，血清和肝脏中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平升高，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性增强，CEE处理显著逆转了这些变化。CEE组与FLHS组肝脏间共有93种差异代谢物，如1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油（1-stearoyl-2-arachidoylglycerol）、N,N-二甲基磷脂酰乙醇胺（PE-NMe₂）和19-羟基花生四烯酸（19-hydroxyarachidonic acid）等。KEGG富集分析表明，差异代谢物主要富集于自噬信号通路。CEE处理显著抑制了磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）/mTOR、p62、脂肪酸合成酶（Fasn）、乙酰辅酶A羧化酶（Acc）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Pparγ）的蛋白水平，同时显著提高了磷酸化UNC-51样激酶1（p-Ulk1）/Ulk1、自噬相关蛋白5（Atg5）、微管相关蛋白1轻链3II型/I型比值（LC3^II/LC3^I）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（Pparα）的蛋白水平（P < 0.05或P < 0.01）。综上所述，15 g/kg CEE补充可有效缓解蛋鸡FLHS，通过激活自噬调控肝脏脂质代谢。CEE为FLHS治疗提供了一种新型药理学策略，凸显了菊苣在禽类中的潜在应用价值。

脂肪肝出血综合征（FLHS）是一种常见于笼养蛋鸡产蛋期的营养代谢性疾病，病理特征表现为肝脏过度脂肪沉积和出血，与人类代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）具有高度相似性。蛋鸡肝脏在脂质合成中发挥核心作用，为蛋品生产提供必需脂质；当脂质合成与氧化分解失衡时，便会导致肝脏脂质沉积。在产蛋高峰期（26-30周龄）和产蛋后期（40-60周龄），FLHS可导致产蛋量急剧下降和死亡率增加，给家禽业造成重大经济损失。目前尚无经批准的有效治疗药物用于FLHS的预防和治疗，这对蛋鸡管理和家禽业可持续发展构成重大挑战。传统医学中，许多膳食成分兼具营养与治疗价值，在MAFLD管理中显示出相当潜力。药食同源植物已被公认为防治FLHS的有效策略。菊苣（Cichorium intybus L.）是一种兼具药用和食用价值的多功能植物，原产于欧洲和地中海地区，2002年被中国卫生部正式批准为功能性食品原料。菊苣富含多糖、黄酮类、萜类和生物碱等次生代谢产物，药理研究表明这些生物活性成分具有保肝、降脂、降糖作用，并能增强动物生产性能。然而，菊苣在蛋鸡产蛋后期肝脂肪变性中的药理效应和作用机制尚未被探索。

本研究旨在利用UPLC-MS/MS整合网络药理学鉴定CEE抗FLHS的生物活性成分，并从非靶向肝脏代谢组学角度，结合网络药理学阐释菊苣缓解蛋鸡FLHS的潜在机制。该论文发表在《Poultry Science》期刊，为菊苣改善家禽肝脏健康和营养代谢紊乱提供了新的药理学策略。

研究人员开展研究时主要用到的关键技术方法包括：采用UPLC-MS/MS进行CEE化学成分分析与生物活性成分鉴定；运用网络药理学手段（包括TCMSP和TCM Database@Taiwan数据库获取活性成分靶点，GeneCards和DisGeNET数据库获取疾病靶点，String数据库进行蛋白互作分析，Cytoscape软件进行网络可视化，Metascape平台进行GO和KEGG富集分析）预测菊苣抗FLHS的作用靶点与通路；采用分子对接技术验证活性成分与自噬相关靶点的结合能力；建立HELP饲粮诱导的FLHS蛋鸡模型（72只50周龄海兰褐蛋鸡，随机分为NC组、FLHS组和CEE添加组，试验期12周）；检测生产性能与蛋品质指标；进行肝脏组织病理学观察（H&E染色和油红O染色）及血清和肝脏生化指标检测；采用LC-MS/MS进行肝脏非靶向代谢组学分析；运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测自噬相关基因mRNA表达水平；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测自噬和脂质代谢相关蛋白表达水平。

研究结果部分包含以下几个主要方面：

CEE化学成分与活性化合物鉴定：CEE提取率为33.65%，UPLC-MS/MS分析共鉴定出1099种化合物，主要类别为萜类（24.84%）、酚酸类（17.11%）、生物碱类（15.56%）和黄酮类（15.10%）。网络药理学从菊苣中筛选出8种生物活性成分，结合UPLC-MS/MS鉴定结果，确定三种重叠化合物为山莴苣苦素、2S,2′S-橙黄酰胺乙酸酯和木犀草素，这些化合物可能作为CEE治疗FLHS的活性成分。

菊苣抗FLHS的网络药理学分析：从TCMSP和TCM Database@Taiwan数据库筛选出13个菊苣生物活性成分，经去重后获得83个靶点；从DisGeNET和GeneCards数据库检索到928个FLHS相关疾病靶点。Venn图分析显示33个重叠靶点，占菊苣靶点的39.76%。PPI网络分析结合MCODE插件筛选出核心靶点BCL2、IL6、PPARG、ESR1和CASP3。GO富集分析显示生物过程主要富集于凋亡和细胞周期，细胞组分主要富集于内体膜、线粒体膜和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，分子功能主要富集于细胞因子和蛋白酶活性。KEGG富集分析表明mTOR信号通路、自噬和胰岛素抵抗等信号通路可能参与菊苣调控FLHS的机制。

CEE对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响：试验第6周和第12周末，FLHS组蛋鸡体增重显著高于NC组；CEE处理在第12周显著降低HELP饲粮诱导的体增重增加。与NC组相比，FLHS组产蛋率和蛋重降低，料蛋比显著增加；与FLHS组相比，CEE组产蛋率和蛋重增加，料蛋比显著降低。蛋品质分析显示，与NC组相比，FLHS组哈氏单位和蛋白高度显著降低；与FLHS组相比，CEE组哈氏单位和蛋白高度显著增加。

CEE对肝组织形态和功能的影响：组织病理学结果显示，HELP饲粮诱导肝细胞空泡变性、核固缩和核溶解，肝小叶结构破坏，伴有红细胞浸润；油红O染色显示肝脏脂质滴大量积累，小脂质滴融合为大脂质滴，油红O阳性面积显著增加。CEE处理显著改善肝脏组织病理学，肝脂肪变性减轻，肝细胞过度脂质滴积累显著减少。与NC组相比，FLHS组血清和肝脏中TG、TC水平显著升高，血清HDL-C水平极显著降低、LDL-C水平极显著升高，血清ALT和AST活性增强；与FLHS组相比，CEE处理显著降低血清和肝脏TG、TC水平，极显著提高血清HDL-C水平、极显著降低LDL-C水平，极显著逆转HELP诱导的ALT和AST活性升高，并极显著降低肝脏NEFA水平。

肝脏非靶向代谢物分析：LC-MS/MS分析共检测到2910种代谢物，正离子模式1567种，负离子模式1343种。PCA分析显示CEE组内样本聚类紧密，OPLS-DA分析显示组间分离趋势明显、组内聚类度高。FLHS组与CEE组比较，69种代谢物上调、67种代谢物下调。根据筛选标准共鉴定出93种显著差异表达代谢物，主要包括脂类、氨基酸、有机酸及其衍生物。KEGG功能注释显示这些差异代谢物主要富集于自噬、甘油磷脂代谢和胰岛素抵抗等通路。在自噬通路中，CEE处理显著下调TG（14:0/18:1(9Z)/15:0）、磷脂酰胆碱PC（16:0/20:2(11Z,14Z)）和1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油，显著上调PE-NMe₂、磷脂酰乙醇胺（PE）、19-羟基花生四烯酸、2-甲酰戊二酸、磷脂酰丝氨酸PS（18:1(9Z)/0:0）和PS（22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)）。

CEE通过激活自噬抑制FLHS：分子 docking 结果显示，山莴苣苦素、2S,2′S-橙黄酰胺乙酸酯和木犀草素与Ulk1的结合能分别为-9.85、-5.06和-7.34 kcal/mol，与Atg5的结合能分别为-10.27、-6.16和-6.85 kcal/mol，表明CEE活性成分与自噬相关靶点具有较强结合亲和力。qRT-PCR分析显示，FLHS组mTOR mRNA上调，CEE处理显著逆转此上调；与FLHS组相比，CE处理显著增加Ulk1、Atg5和LC3 mRNA表达，显著降低p62 mRNA表达。Western blot分析显示，与NC组相比，FLHS组LC3^II/LC3^I水平极显著降低；与FLHS组相比，CEE处理显著降低p-mTOR/mTOR和p62蛋白水平，显著增加p-Ulk1/Ulk1、Atg5和LC3^II/LC3^I水平。脂质代谢相关蛋白分析显示，与NC组相比，FLHS组Fasn、Pparγ和Pparα水平显著增加；与FLHS组相比，CEE处理显著降低Fasn、Acc和Pparγ蛋白水平，显著增加Pparα表达。

讨论部分，研究人员首先指出集约化家禽养殖管理模式下，高强度连续产蛋导致肝脏脂质代谢失衡，随着蛋鸡日龄增加FLHS患病率上升，因此预防和治疗FLHS十分重要。植物源性饲料添加剂因其成本低且有益健康效应而成为研究热点，菊苣作为代表性药食同源植物，其在产蛋后期肝脂肪变性中的药理效应和机制尚未被探索。网络药理学预测菊苣抗FLHS的活性靶点占其总靶点的39.76%，表明菊苣对FLHS具有较强靶向治疗效应。UPLC-MS/MS结合网络药理学筛选出的三种活性成分中，山莴苣苦素属于倍半萜内酯类，可显著降低游离脂肪酸诱导的HepG2细胞中TG积累，通过调控SQSTM1/p62和GBA基因表达激活脂肪酸氧化信号通路发挥抗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）效应；木犀草素具有抗肥胖作用；2S,2′S-橙黄酰胺乙酸酯研究有限，但具有显著抗炎和抗病毒活性。GO细胞组分富集于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，KEGG富集于mTOR、自噬和胰岛素抵抗等信号通路。

研究人员进一步讨论，本研究中CEE处理显著降低蛋鸡第12周末体增重，逆转HELP饲粮诱导的产蛋率、蛋重和料蛋比下降，显著恢复哈氏单位和蛋白高度，表明CEE对FLHS蛋鸡生产性能和蛋品质具有有益效应。CEE显著降低血清和肝脏TG、TC水平，逆转HDL-C降低和LDL-C升高，降低肝脏NEFA水平并抑制脂质滴形成；肝脏蛋白分析显示CEE显著降低Fasn、Acc和Pparγ蛋白表达，增加Pparα水平，表明CEE恢复了蛋鸡机体和肝脏的脂质代谢稳态。CEE还显著降低AST和ALT活性，改善肝功能。肝脏非靶向代谢组学鉴定出93种差异代谢物，功能注释主要富集于自噬、甘油磷脂代谢和胰岛素抵抗信号通路；网络药理学靶点和非靶向肝脏代谢物均富集于自噬信号通路，表明CEE可能通过该通路发挥关键抗FLHS效应。缺陷性脂噬与FLHS相关，HELP和棕榈酸分别在蛋鸡肝脏和LMH细胞中诱导LC3和p62积累，抑制自噬体酸化，导致自噬受损。本研究中，CEE筛选出的三种生物活性成分与Ulk1和Atg5进行分子对接，结合能均低于-5 kcal/mol；CEE抑制mTOR磷酸化，增加p-Ulk1/Ulk1、Atg5和LC3-II/LC3-I水平，促进p62降解，表明CEE通过激活肝脏自噬缓解HELP诱导的肝脂肪变性和脂质代谢失衡。本研究的局限性在于仅初步探究了mTOR及其下游自噬标志物在基因和蛋白水平的变化，CEE诱导自噬激活的上游调控信号尚待阐明，且自噬对FLHS病理中脂质分解代谢的相对贡献仍不清楚，未来研究应结合多组学分析和自噬抑制剂或激活剂的功能干预实验。

结论部分翻译如下：综上所述，本研究通过体外网络药理学分析和体内动物评估，初步证实了15 g/kg CEE对HELP饲粮诱导的产蛋后期蛋鸡FLHS的治疗效果。CEE的三种关键成分（山莴苣苦素、2S,2′S-橙黄酰胺乙酸酯和木犀草素）通过激活自噬调控脂质代谢紊乱。本研究为药食同源植物菊苣改善家禽肝脏健康和营养代谢紊乱提供了新型药理学策略。