CsCAB1在调控茶树叶片颜色变异中的功能分析

《Scientia Horticulturae》：Functional analysis of CsCAB1 in regulating leaf color variation in tea plants (Camellia sinensis)

　　

白化叶是茶树中一种有价值的农艺性状，以其独特的颜色以及相关的优良品质和健康益处为特征。在本研究中，研究人员鉴定了一个同时具有绿色和黄色枝条的白化突变体'福安大白茶'，并对其进行了全长转录组分析。叶绿素a/b结合（CAB）基因家族成员在黄叶和绿叶中表现出显著差异表达。在拟南芥中的功能互补实验表明，CsCAB1能够挽救cab突变体的黄化表型。过表达株系显示叶绿素a含量增加，且叶绿素生物合成相关基因的表达水平上调。酵母双杂交（Y2H）筛选和验证揭示，CsCAB1与类囊体相关蛋白相互作用，包括类囊体形成1（CsTHF1）和光系统II放氧增强蛋白（CsPsbP1）。进一步的双分子荧光互补（BiFC）实验确认这些相互作用发生在叶绿体上，提示其在调控光系统Ⅱ（PSⅡ）复合物的组装和稳定性中发挥作用。这些发现表明，CsCAB1通过影响叶绿素a代谢和光系统复合物完整性的协同机制调控茶树白化变异。

**论文解读：CsCAB1通过协同调控叶绿素a代谢与光系统II复合物完整性介导茶树叶片颜色变异**

茶叶叶片颜色变异，尤其是白化（albino）表型，是茶树中一个受高度关注的农艺性状，因白化茶具有独特的叶色和提升的鲜爽度、降低涩味等品质优势，受到研究和商业领域的广泛兴趣。然而，白化表型的分子调控机制尚不完全清楚。已有研究表明，白化叶片中叶绿体结构异常，类囊体膜排列紊乱，且叶绿素含量显著下降，但调控这些过程的关键基因及其作用网络仍需深入解析。该研究发表于《Scientia Horticulturae》，以茶树白化突变体'福安大白茶'（同时具有绿色和黄色枝条）为材料，旨在鉴定调控叶色变异的候选基因CsCAB1（叶绿素a/b结合蛋白家族成员），并阐明其通过叶绿素代谢和光系统复合物稳定性的协同调控机制。

研究人员首先利用同一植株上的绿色和黄色叶片进行全长转录组分析，发现差异表达基因显著富集于光合作用和叶绿素结合通路，其中CAB基因家族所有成员在绿叶中显著上调。基于先前生物信息学分析锁定的关键候选基因CsCAB1，通过拟南芥异源互补实验验证其功能，随后利用酵母双杂交（Y2H）文库筛选和双分子荧光互补（BiFC）实验鉴定并验证其互作蛋白。

**主要关键技术方法：**

1. **全长转录组分析**：样本来自福建省农业科学院茶叶研究所实验茶园（福安）的'福安大白茶'突变体，2021年8月12日采集同一植株上绿色和黄色枝条的顶芽下第一片完全展开叶，设置3个生物学重复，用于差异表达基因、GO和KEGG富集分析。
2. **拟南芥异源功能互补**：将CsCAB1编码序列构建至pBWA(V)BS-GFP-35S载体，通过花序侵染法转化拟南芥cab突变体（SALK_134810C），筛选纯合过表达株系，在30,000 lx高光胁迫和正常条件下观察表型并测定叶绿素含量。
3. **酵母双杂交筛选与验证**：以pGBKT7-CsCAB1为诱饵，筛选茶树叶片的pGADT7文库，并经自激活检测后，从105个阳性克隆中鉴定出候选互作蛋白，再通过成对共转化验证CsCAB1与CsPsbP1和CsTHF1的互作。
4. **双分子荧光互补（BiFC）验证**：将CsCAB1与YFP N端融合，CsPsbP1和CsTHF1分别与YFP C端融合，共转化本氏烟草叶片，利用共聚焦显微镜检测YFP荧光与叶绿体自发荧光的共定位。

**研究结果：**

**3.1 CsCABs在'福安大白茶'绿叶和白化叶中差异表达**
通过全长转录组分析绿叶与黄叶的差异表达基因（DEGs），共获得2153个DEGs（1068个上调，1085个下调）。GO富集分析显示，分子功能中“叶绿素结合”和“色素结合”显著富集；细胞组分中绝大部分（19/20）与叶绿体、类囊体、光系统相关；生物过程中“光合作用”和“光合作用，光捕获”富集最显著。KEGG分析表明，“光合作用-天线蛋白”通路（Ko00196）富集到27个基因，其中21个为CAB基因（Lhca和Lhcb亚类）。所有CAB家族成员在绿色叶片中表达量显著高于黄色叶片。

**3.2 过表达CsCAB1增加转基因拟南芥叶绿素a含量**
在正常条件下，CsCAB1过表达株系（OE1和OE2）与野生型（WT）和cab突变体相比，形态无显著差异，但叶绿素a含量显著高于WT和cab突变体。高光胁迫处理后，WT和cab突变体出现萎蔫和黄化，而OE1和OE2叶片更绿。叶绿素a含量测定表明，OE1和OE2显著高于WT和cab突变体（P<0.05）；OE2叶绿素b和总叶绿素含量也显著高于cab突变体；叶绿素a/b比值在OE2中显著高于cab突变体。相关性分析显示，CsCAB1表达水平与叶绿素a含量在正常条件（r=0.853）和高光胁迫（r=0.831）下均呈强正相关（P<0.01）。

**3.3 CsCAB1通过调控相关基因表达影响叶绿素代谢途径**
利用qPCR检测叶绿素代谢关键基因表达，结果显示，过表达株系中叶绿素合成基因（AtHEMA1、AtCHLD、AtCRD1、AtPORA）表达水平显著高于WT和cab突变体；而叶绿素降解基因（AtNOL、AtSGR、AtPPH、AtPAO）表达水平普遍降低，其中AtNOL降幅最大。该表达模式在正常和高光条件下一致，表明CsCAB1通过促进合成和抑制降解增强叶绿素积累。

**3.4 CsCAB1直接与类囊体膜蛋白相互作用**
通过Y2H文库筛选（初级文库容量1.2×10⁷ cfu，次级文库1.3×10⁷ cfu），自激活检测确认CsCAB1无自激活活性后，从105个阳性克隆中鉴定出68个独特基因。经功能注释，锚定了两个候选蛋白：CsPsbP1（光系统II放氧增强蛋白）和CsTHF1（类囊体形成1）。成对Y2H验证显示，CsCAB1与CsPsbP1和CsTHF1分别在TDO/X培养基上生长并变蓝，但在QDO/X上不生长，表明存在特异性互作。

**3.5 CsCAB1在叶绿体内与CsPsbP1和CsTHF1相互作用**
BiFC实验在本氏烟草叶片中证实，CsCAB1-YFP^N与CsPsbP1-YFP^C或CsTHF1-YFP^C共表达时，产生强烈的YFP荧光信号，且与叶绿体自发荧光完全重叠。所有阴性对照（空载体配对）均无荧光，阳性对照（D3-BRZ1）显示荧光。这证实CsCAB1与CsPsbP1和CsTHF1在叶绿体内发生直接互作。

**讨论与结论**
讨论部分指出，CAB蛋白是光系统II（PSII）外周天线复合物的核心组分，其表达抑制与白化茶叶片中类囊体结构紊乱和光系统脆弱性密切相关。本研究中CsCAB1的过表达显著提升叶绿素a含量，且通过上调HEMA1、CHLD、CRD1和PORA等限速基因促进叶绿素a生物合成，同时下调降解基因。此外，CsCAB1与CsPsbP1（参与PSII复合物组装/稳定性）和CsTHF1（参与类囊体膜生物发生）的物理互作，提示其可能影响PSII复合物的组装与稳定性。综合这些发现，结论如下：本研究通过转录组分析从白化突变体'福安大白茶'中鉴定出关键候选基因CsCAB1，利用拟南芥互补实验确认其调控叶色变异的功能，并通过Y2H和BiFC系统筛选并验证了互作蛋白。据此提出调控模型：CsCAB1一方面通过反馈调节叶绿素a生物合成关键基因（HEMA、CHLD、CRD、PORA）影响叶绿素a积累；另一方面通过与CsTHF1和CsPsbP1的直接互作影响PSII复合物的组装与稳定性，两者协同作用最终导致茶树叶片白化表型。