利用钴包覆的氮掺杂碳与Exonuclease III放大技术，实现蔬菜中毒死蜱残留的超灵敏检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Harnessing a powerful duo of cobalt-encapsulated nitrogen-doped carbon and Exonuclease III amplification for ultrasensitive profenofos residue sensing in vegetables

　　

刘彦君|郝林|张一欣|张玉凡

中国河北省保定市071002，河北大学化学与材料科学学院，国家新药制剂与辅料重点实验室、教育部药物化学与分子诊断重点实验室、河北省分析科学技术重点实验室

摘要

本研究开发了一种基于复合材料的适配体传感器，用于快速灵敏地检测丙氟磷。通过十二面体ZIF-67的高温碳化处理，制得了钴包覆的氮掺杂碳材料（Co–NC），该材料具有丰富的活性位点且电子传输能力较强。随后，为了便于探针固定，又制备了经酸功能化的Co–NC（Co–NC-COOH）。当适配体特异性识别丙氟磷后，会释放互补DNA，进而触发外切核酸酶III介导的循环信号放大过程。固定在Co–NC-COOH上的发夹形DNA会被不断切割，生成短DNA片段，这些片段与信号DNA杂交，从而增强电化学响应。该适配体传感器具有0.1至316纳克/毫升的宽线性检测范围，检测限低至13.12皮克/毫升。此外，在蔬菜样品中，该传感器还表现出优异的选择性以及95.29%至104.03%的良好回收率，显示出在检测丙氟磷残留方面的巨大潜力。

引言

蔬菜是人类饮食中的重要组成部分，也是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源[1]、[2]、[3]。为提高农业生产力并减少病虫害造成的作物损失，现代农业体系中广泛使用了农药[4]。然而，过度且随意使用农药已成为严重的公共卫生和环境问题，因为农药残留在食品中可能对生态系统和人类健康造成不良影响[5]、[6]、[7]、[8]。在各类农药中，丙氟磷是一种广泛使用的有机磷杀虫剂，它由中国自主研发，常用于农作物、蔬菜和水果的杀虫处理[9]。由于其稳定的化学结构和高杀虫效率，丙氟磷在农业生产中被大量应用[10]。但长期接触或摄入蔬菜中的丙氟磷残留物可能导致其在人体内积累，进而引发中毒。丙氟磷会通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性而产生神经毒性，可能引发肺水肿、呼吸衰竭甚至死亡等严重症状[11]、[12]、[13]、[14]。此外，不当处理和使用丙氟磷还会造成环境污染[15]。因此，开发可靠且灵敏的丙氟磷检测方法至关重要。目前，已有多种分析技术被用于丙氟磷的检测，包括液相色谱法[16]、比色法[17]、酶抑制法[18]、荧光光谱法[19]、电化学发光法[20]、[21]以及电化学适配体传感器[22]、[23]。适配体是由核苷酸序列构成的单链DNA或RNA分子，对目标分析物具有高亲和力和特异性。此外，适配体还具有成本低、稳定性好、易于储存等优点，因此成为构建生物传感器的理想识别元件[24]、[25]、[26]、[27]。在各类检测技术中，电化学适配体传感器因其操作简单、响应迅速且成本较低而备受关注，近年来在农药残留检测领域发展迅速[28]、[29]、[30]、[31]。

随着金属有机框架材料的不断发展，由于其可调控的化学性质和独特的多孔结构，这类材料在电化学适配体传感器中的应用日益增多[32]。沸石咪唑骨架-67是一种典型的金属有机框架材料，它由钴离子和2-甲基咪唑组成[33]。在氮气氛围下，ZIF-67可通过高温碳化处理转化为钴嵌入的氮掺杂碳材料，这类材料具有较高的电导率以及丰富的活性位点。此外，其较大的比表面积还有助于提高DNA链的固定效率，进而提升传感性能[34]、[35]。金纳米棒因其稳定的化学性质、良好的生物相容性以及易于表面功能化，而被广泛用作生物传感器中的电极活性材料[36]。作为电极活性材料，金纳米棒可以通过电极表面对对乙酰氨基酚的氧化作用产生电化学信号，从而实现丙氟磷的间接检测。目前，外切核酸酶III这种不受序列限制的功能酶已被广泛应用于电化学适配体传感器中。外切核酸酶III能够识别5’端突出的或平端的双链DNA，并以3’→5’方向水解磷酸二酯键，从而逐步释放脱氧核苷酸[37]、[38]、[39]。基于这些特性，外切核酸酶III可以引发循环切割反应，进而实现电化学传感平台中的高效信号放大[40]。

在本研究中，研究人员采用了双重放大策略，将具有较大比表面积和高电导率的酸功能化钴嵌入氮掺杂碳材料（Co–NC-COOH）与外切核酸酶III引发的循环反应相结合，以此放大电化学信号。在传感过程中，适配体首先与其互补DNA发生杂交。当丙氟磷出现后，目标物质会特异性结合到适配体上，从而导致互补DNA释放。释放出的互补DNA会进一步打开经过氨基修饰的发夹形DNA，形成平端双链DNA结构。当外切核酸酶III识别到这些平端双链DNA后，会选择性切割互补链，使完整的互补DNA重新进入反应循环，从而实现信号放大。与此同时，发夹形DNA剩余的单链片段则仍固定在经过电极处理的材料上，与连接到金纳米棒上的信号DNA发生杂交。这一过程可促进对氨基苯酚的催化氧化，进而产生可检测的电化学信号。基于这一策略，研究人员成功构建了一种电化学适配体传感器，可用于灵敏检测蔬菜中的微量丙氟磷残留。整个传感机制如图1所示。

章节节选

试剂

四氯金酸（HAuCl?·3H?O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、抗坏血酸、硝酸银（AgNO?）、2-巯基乙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、醋酸甲胺磷、噻嗪酮、马拉硫磷、氯氟氰菊酯、噻虫嗪以及Nafion（45%）均购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。氯化钾、硝酸、无水乙醇、甲醇、六水合硝酸钴（Co(NO?)?·6H?O，纯度≥99%）则从其他供应商处获取。

PAGE设计策略分析

为验证所提出的传感策略的可行性，研究人员采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析了丙氟磷检测过程中由目标物质触发的反应。如图S1所示，各泳道中加入了等浓度的DNA。泳道1和泳道2分别含有适配体和互补DNA，而泳道3则同时含有这两种物质。泳道3的迁移位置明显不同于泳道1和泳道2，这表明适配体与互补DNA之间已经成功发生了杂交。

结论

综上所述，通过ZIF-67的高温碳化处理，研究人员制得了具有高电导率和较大比表面积的钴嵌入氮掺杂碳材料，随后对其进行了酸功能化处理以便用于电极修饰。同时，研究人员还采用了基于外切核酸酶III引发的循环反应的双重信号放大策略，以此增强电化学响应。所构建的电化学适配体传感器具有0.1至316纳克/毫升的宽线性检测范围，检测限低至13.12皮克/毫升，且性能优异。

CRediT作者贡献说明

张一欣：论文撰写——初稿撰写、验证、资源获取、实验研究、正式分析、概念构思。张玉凡：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源获取、方法设计、实验研究、资金申请、正式分析、数据整理、概念构思。刘彦君：论文撰写——审阅与编辑、软件应用、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。郝林：论文撰写——初稿撰写、软件应用、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了河北省分析科学技术重点实验室（编号22567620H）、河北省高层次人才团队建设专项项目（编号253A5501D）以及河北大学跨学科研究计划（编号DXK202406）的支持。

刘彦君是河北大学化学与材料科学学院的硕士生，她的研究方向为电化学生物传感器。