LCAL4-FUS协同作用激活MMP13并驱动乳腺癌溶骨性骨转移

《Oncogene》：LCAL4–FUS cooperation switches on MMP13 and drives osteolytic bone metastasis in breast cancer

　　

晚期乳腺癌（BC)患者常发生骨转移，导致严重骨骼并发症及预后显著下降，但乳腺癌骨转移的分子机制尚未得到充分阐明。本研究发现长链非编码RNA LCAL4在骨转移性乳腺癌中特异性上调，并可作为不良生存的独立预测因子。在体内心脏注射和胫骨注射小鼠模型中的功能获得和功能丧失实验表明，LCAL4过表达显著增强乳腺癌细胞介导的溶骨性骨转移。机制上，LCAL4作为分子支架，直接与RNA/DNA结合蛋白FUS结合，促进其核内积累并将其募集至MMP13启动子区域。LCAL4-FUS核糖核蛋白复合物进而募集RNA聚合酶II并诱导H3K4me3^沉积，从而激活MMP13转录。分泌型MMP13刺激破骨细胞分化并增强骨吸收活性。被吸收的骨质释放TGF-β，进一步加速肿瘤增殖，建立自我强化的恶性循环以驱动溶骨性转移。值得注意的是，遗传学手段破坏LCAL4-FUS-MMP13通路可显著抑制乳腺癌骨转移。这些发现强调了LCAL4-FUS-MMP13轴在乳腺癌骨骼定殖和溶骨性进展中的关键作用，提示其作为乳腺癌骨转移治疗靶点的潜力。

## 研究背景

乳腺癌（BC)是全球最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的首要原因。骨是乳腺癌最常见的转移部位，约58%的转移性乳腺癌患者存在骨骼受累。乳腺癌骨转移以溶骨性为主，46%的骨转移患者会经历骨相关事件（SREs)，包括高钙血症、病理性骨折、严重疼痛和脊髓压迫，这些严重影响患者生活质量并降低总生存期（OS)。研究表明，无骨转移患者的五年生存率为75.8%，而有骨转移者仅为8.3%，发生SREs者更是低至2.5%。然而，由于对其分子机制了解不足，针对乳腺癌骨转移的有效治疗策略仍然有限。

长链非编码RNA（lncRNA)是一类长度超过500个核苷酸、不编码蛋白质的RNA转录本。大量研究证实lncRNA在细胞分化、发育及多种生理过程中发挥关键调控作用。lncRNA可直接与DNA、RNA和蛋白质相互作用，或作为支架/向导介导蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用，影响染色质结构、剪接、转录、蛋白翻译、定位及RNA加工等过程。lncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种人类疾病发生发展密切相关。已有研究提示lncRNA参与骨转移的调控，例如lncRNA MAYA作为支架促进LLGL2-MAYA-NSUN6复合物组装，连接ROR1-HER3信号轴与Hippo-YAP通路，促进乳腺癌溶骨性骨转移；lncRNA Lnc34a则通过表观遗传沉默miR-34a表达，激活TGF-β/Smad4通路，促进肝细胞癌骨转移。

LCAL4（LINC01614, ENSG00000230838）是位于2q35染色体位点的lncRNA，近期研究证实其在呼吸、消化、神经和内分泌系统等多种人类癌症中高表达，且与不良临床结局相关。在分子层面，LCAL4通过结合GSK-3β或微小RNA（如miR-520a-3p和miR-217)作为诱饵，激活WNT/β-catenin和PI3K/AKT等下游致癌通路，增强肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。在乳腺癌中，LCAL4表达升高且其高表达预测更短的无病生存期（DFS)。生物信息学分析进一步揭示高LCAL4表达与TGF-β1反应、CDH1信号和细胞黏附等基因特征相关。沉默LCAL4可抑制上皮-间质转化（EMT)并增加MCF7乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。然而，LCAL4在乳腺癌骨转移中的生物学作用和机制参与在很大程度上仍未被探索。

## 研究设计与主要方法

本研究采用的技术方法主要包括：基于中山大学肿瘤防治中心临床样本队列（10例癌旁正常乳腺组织及132例存档石蜡包埋乳腺癌标本）的组织样本分析；RNA荧光原位杂交（FISH)技术用于检测LCAL4表达定位；RNA pull-down联合质谱（MS)鉴定LCAL4结合蛋白；RNA免疫沉淀（RIP)验证LCAL4与FUS的相互作用；染色质免疫沉淀（ChIP)-qPCR分析FUS在MMP13启动子的占位及组蛋白修饰；染色质RNA纯化（ChIRP)技术确认LCAL4与MMP13启动子的直接结合；以及多种体内功能验证模型，包括免疫缺陷型（BALB/c裸鼠）和免疫健全型（C57BL/6小鼠）的颅内注射及心内注射骨转移模型、μCT影像学分析、生物发光成像（BLI)等。

## 研究结果

### 高LCAL4表达预示乳腺癌患者不良骨转移无生存结局

研究人员首先通过FISH分析发现，LCAL4在骨转移性乳腺癌（原发肿瘤）中显著富集，骨病灶内信号最强；而在肺转移性肿瘤及肺转移灶中表达较低，在正常乳腺上皮或非转移性原发肿瘤中几乎检测不到。qPCR进一步证实骨转移性乳腺癌和骨转移灶中LCAL4水平升高。临床分析表明，高LCAL4表达与晚期疾病分期和骨转移显著相关，是不良骨转移无生存期（BMFS)的独立预后因素。TCGA-BRCA和GEO队列数据验证显示，高LCAL4表达与总生存期（OS)、无病生存期（DFS)、无复发生存期（RFS)、疾病特异性生存期（DSS)和无进展生存期（PFS)降低相关。bc-GenExMiner v.2数据分析进一步揭示高LCAL4表达与多种亚型的远处转移无生存期（DMFS)降低相关。

### LCAL4促进小鼠溶骨性骨转移并降低生存率

功能研究表明，LCAL4过表达显著加速转移发生并增加后肢骨骼肿瘤负荷，μCT证实其加重溶骨性骨破坏。TRAP染色和H&E显示MCF7/LCAL4组骨-瘤界面处溶骨病灶扩大、TRAP阳性破骨细胞显著增加。2个月终点时，MCF7/LCAL4组骨转移发生率达83.3%，而对照组仅16.7%。相反，LCAL4敲低显著减少MDA-MB-231细胞胫骨注射模型中的骨骼肿瘤负荷和溶骨病灶。在免疫健全的C57BL/6小鼠同基因模型中，LCAL4过表达同样增加骨骼肿瘤负荷、加重胫骨溶骨性病变并提升骨-瘤界面破骨细胞数量，证实该表型不局限于免疫缺陷模型。此外，LCAL4反义寡核苷酸（ASO)治疗显著降低骨转移发生率、骨骼肿瘤负荷和溶骨病灶。

### 乳腺癌细胞中LCAL4上调诱导破骨细胞生成

GSEA分析显示LCAL4正相关基因显著富集于细胞外基质（ECM)重塑、软骨发育、蛋白分泌、EMT和TGF-β信号等通路。功能实验表明，LCAL4过表达细胞的条件培养基（CM)显著增加RAW264.7巨噬细胞/前破骨细胞中TRAP阳性多核破骨细胞数量和TRAP酶活性，而LCAL4敲低则抑制两者。ELISA检测显示各组CM中PTHrP、IL-17或TNF-α水平无显著变化，且不影响MC3T3-E1前成骨细胞中RANKL/OPG比值，表明LCAL4特异性调控破骨细胞谱系。骨吸收实验证实LCAL4过表达CM显著增强陷窝形成，而LCAL4敲低CM抑制骨基质吸收。此外，LCAL4过表达CM处理的RAW264.7细胞在矿化骨基质上释放更多TGF-β1，该破骨细胞源性、富含TGF-β1的CM显著刺激乳腺癌细胞增殖，而LCAL4敲低CM则抑制增殖，表明LCAL4上调驱动破骨细胞生成并建立促进骨转移微环境肿瘤生长的正反馈环路。

### LCAL4过表达乳腺癌细胞分泌MMP13促进破骨细胞分化和激活

通过整合TCGA-BRCA队列中与LCAL4强相关基因、GSE14017数据集骨转移病变上调基因以及肿瘤-骨界面富集的20种蛋白酶三个基因集，研究人员鉴定出MMP13和CTSK为关键候选分子。RT-PCR显示LCAL4过表达以剂量依赖性方式上调MMP13，而CTSK表达不受影响。LCAL4过表达显著增加乳腺癌细胞中MMP13 mRNA和蛋白水平，LCAL4敲低则降低其水平；相应CM中MMP13分泌量亦呈现相同趋势。MMP13敲除消除了LCAL4过表达CM促进RAW264.7分化的能力，而外加重组MMP13则可恢复LCAL4敲低CM的促分化效应。鬼笔环肽免疫荧光显示LCAL4过表达CM强烈诱导成熟破骨细胞中外周F-肌动蛋白丰富的足体环形成，而MMP13敲低抑制肌动蛋白环形成和前破骨细胞融合；LCAL4敲低CM导致破碎的肌动蛋白结构，重组MMP13可恢复足体环形成并促进前破骨细胞融合。体外骨吸收实验证实MMP13敲除消除了LCAL4诱导的破骨细胞骨吸收活性，重组MMP13则挽救了被抑制的破骨细胞激活。

### LCAL4与FUS相互作用并促进其核内积累

RNA pull-down/MS鉴定出RNA/DNA结合蛋白FUS为LCAL4结合伙伴。RNA pull-down证实LCAL4正义探针可有效捕获内源性FUS，RIP显示FUS免疫沉淀物中LCAL4显著富集。免疫荧光/RNA-FISH显示LCAL4与FUS在乳腺癌细胞中共定位，且在骨转移病灶肿瘤细胞中较配对原发肿瘤显著增强。UNAFold二级结构预测将LCAL4分为四个结构片段，截断实验确定1245-1722核苷酸区域为FUS结合所必需。FUS结构域分析表明，RNA识别基序（RRM)结构域缺失完全消除LCAL4结合，证实RRM结构域对该相互作用至关重要。

亚细胞分析显示LCAL4过表达增加核内FUS水平、降低胞质表达，LCAL4敲低则呈现相反模式。免疫荧光证实LCAL4过表达使FUS集中于核内并减少胞质存在，LCAL4沉默则逆转该分布。机制研究表明，LCAL4通过增强FUS与核输入受体Transportin-1（TNPO1)的相互作用促进其核输入；LCAL4显著促进野生型FUS核积累，而对缺失PY-NLS结构域的FUS ΔNLS突变体无此效应，表明LCAL4以PY-NLS依赖性方式通过TNPO1促进FUS核输入。

### LCAL4与FUS协同转录上调MMP13

FUS沉默完全消除LCAL4过表达诱导的MMP13 mRNA和蛋白水平升高，而外源性FUS过表达不能恢复LCAL4敲低抑制的MMP13表达。荧光素酶报告基因实验显示LCAL4过表达增强MMP13启动子活性，该效应被FUS敲低削弱，而强制FUS表达不能逆转LCAL4沉默诱导的启动子活性抑制。ChIP-qPCR确认FUS在MMP13启动子-1060至-1054 bp位点有 robust 占位，LCAL4过表达增强此占位，LCAL4敲低则减弱。同时，LCAL4上调增加RNA聚合酶II募集和H3K4me3^{在MMP13启动子的沉积}，LCAL4沉默则降低两者。生物信息学分析预测-1317至-1307 bp为LCAL4最可能结合位点，ChIRP-Western和ChIRP-PCR证实LCAL4与FUS的物理相互作用以及LCAL4在该MMP13启动子区域的占位。

### 靶向FUS或MMP13阻断LCAL4介导的溶骨性转移

体外破骨细胞分化实验显示FUS沉默消除LCAL4过表达CM的促分化效应，而外源FUS表达不能在LCAL4缺失细胞中显著增加TRAP阳性多核破骨细胞数量。骨吸收实验表明FUS敲低消除LCAL4诱导的破骨细胞骨吸收活性增强，强制FUS表达不能恢复LCAL4缺失抑制的活性。体内实验中，MCF7/LCAL4细胞伴FUS或MMP13敲低的心内注射显著减少后肢肿瘤负荷和溶骨病灶，TRAP染色证实骨-瘤界面破骨细胞数量显著减少，骨转移发生率降低，转移发生延迟，BMFS显著延长。

### LCAL4-FUS-MMP13轴在人乳腺癌中的临床相关性

FISH和免疫组织化学（IHC)检测显示MMP13表达在非转移性乳腺癌、骨转移性乳腺癌和骨转移灶组织中逐步升高，与LCAL4表达趋势平行，而FUS仅呈现轻微不显著增加。qRT-PCR分析证实非骨转移与骨转移乳腺癌组织中LCAL4、FUS和MMP13的表达变化。相关性分析显示LCAL4与MMP13显著正相关（r=0.455, P<0.001)，FUS与MMP13亦显著正相关（r=0.338, P<0.001)，但LCAL4与FUS无显著相关性（r=0.113, P=0.252)。

## 讨论部分总结

LCAL4作为多种人类恶性肿瘤的致癌驱动因子和不良预后标志物已得到广泛认可。本研究首次揭示其在乳腺癌骨转移中的关键作用：LCAL4在骨转移性乳腺癌中显著上调并与更短BMFS相关，在管腔A型（MCF7/T47D)和三阴性乳腺癌（MDA-MB-231)模型中均促进破骨细胞生成和溶骨性骨转移，表明其促转移作用不依赖于分子亚型。机制上，LCAL4通过肿瘤细胞旁分泌MMP13加速骨基质降解，释放的TGF-β1进一步驱动肿瘤扩张和溶骨性转移。靶向LCAL4的shRNA或ASO在体内显著抑制骨转移和溶骨病灶形成，提示其作为预后生物标志物和治疗靶点的潜力。

FUS作为DNA/RNA结合蛋白，在DNA损伤修复、mRNA成熟、选择性剪接及染色质相关转录调控中发挥多重功能。本研究发现FUS是LCAL4的下游效应分子，作为MMP13的直接转录激活因子结合其启动子区域增强表达。由于FUS介导的转录调控具有多效性，未来需进一步探究其是否与其他转录因子或辅因子协同调控MMP13。

溶骨性骨转移由破骨细胞过度激活和肿瘤/基质细胞释放的溶骨因子驱动。MMP13（胶原酶-3)降解I-III型胶原及其他ECM成分（包括骨基质)，重塑ECM并释放隔离的生长因子以促进转移前微环境形成。除肿瘤内在效应外，MMP13还可通过激活pro-MMP9和切割破骨细胞生成抑制因子galectin-3等机制增强破骨细胞分化。本研究揭示的LCAL4-FUS-MMP13转录回路独立于RANKL/RANK信号通路运作，为该轴作为抗RANKL药物（如地诺单抗)或双膦酸盐的补充治疗靶点提供依据。

研究结论：本研究确立了LCAL4-FUS-MMP13轴作为乳腺癌肿瘤内在性溶骨性骨转移驱动因子的地位。LCAL4作为分子支架促进FUS核积累和MMP13启动子募集，诱导染色质重塑和转录激活；分泌型MMP13驱动远处骨骼病变中的破骨细胞生成和骨吸收。药理学抑制该轴（特别是ASO靶向LCAL4、FUS或MMP13)为预防骨转移提供有前景的治疗策略。FUS靶向治疗药物（如用于ALS的Jacifusen/ION363)的临床开发进一步支持该策略的转化潜力。然而，LCAL4轴如何被促破骨细胞因子调控、LCAL4-FUS复合物是否募集染色质修饰酶或其他转录辅因子、以及基质或免疫细胞来源的LCAL4是否参与病理性骨重塑等问题仍有待未来研究阐明。