通过tRNA甲基转移酶10C（TRMT10C）靶向调控成骨细胞N1-甲基腺苷（m1A）修饰逆转线粒体功能障碍并改善骨质疏松症

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Targeting N1-methyladenosine modification in osteoblasts through tRNA methyltransferase 10C reverses mitochondrial dysfunction and ameliorates osteoporosis

　　

骨质疏松症（Osteoporosis）是最常见的退行性全身性骨病之一，伴有成骨细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）的异常下调。尽管人类tRNA甲基转移酶（TRMT10C）基因突变已知可导致OXPHOS功能障碍和早期死亡，但其在骨稳态中的作用仍不清楚。本研究中，研究人员观察到在年龄相关性和雌激素缺乏诱导的骨质疏松症小鼠成骨细胞中，核基因组编码的TRMT10C以及线粒体（mt）基因组编码的OXPHOS亚基表达均显著降低。在sterix（Osx）表达的成骨祖细胞中条件性敲除Trmt10c导致生长发育迟缓、骨量减少和自发性骨折。重要的是，通过多阶段计算机虚拟筛选方法，研究人员首次鉴定出一种新型小分子化合物作为TRMT10C激动剂。该化合物通过药理学激活TRMT10C显著促进了骨形成，并改善了老龄和去卵巢小鼠的骨质疏松表型。机制上，本研究首次提供了TRMT10C除已知的催化mt-tRNA和mt-mRNA的m¹A修饰作用外，还能够结合并催化mt-rRNA的N¹-甲基腺苷（m¹A）修饰的证据。本研究揭示了TRMT10C在骨代谢中的未知作用，并将其确定为骨质疏松症的有前景的治疗靶点。

**研究背景、问题与意义**

骨质疏松症是一种以骨量减少、微结构破坏和骨折风险增加为特征的全身性骨骼疾病，在老年人及绝经后女性中尤为高发。骨稳态的维持依赖于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为成骨细胞的主要祖细胞来源，其向成骨谱系的定向分化与细胞代谢重编程密切相关。在BMSCs成骨分化过程中，细胞能量供应的主要途径从糖酵解转变为氧化磷酸化（OXPHOS），以提供充足的ATP和代谢中间产物支持基质合成、矿化及成骨细胞成熟。然而，在衰老或病理条件下，骨组织细胞的线粒体功能障碍，包括线粒体生物发生受损、膜电位破坏及OXPHOS活性降低，均可导致骨质疏松症的发生。

除转录水平调控外，OXPHOS还受到线粒体RNA（mt-RNA）代谢表观转录组调控的精密调节。RNA N¹-甲基腺苷（m¹A，一种在腺苷N¹位点由特定调控酶添加的动态可逆转录后修饰）可通过引入正电荷并破坏Watson-Crick碱基配对界面，重塑RNA二级结构并调节RNA-蛋白质相互作用，从而影响RNA代谢和翻译等多个过程。TRMT10C作为线粒体tRNA甲基转移酶家族的关键成员，已被报道通过促进mt-tRNA的5′端加工及催化mt-tRNA和mt-mRNA的m¹A修饰来维持线粒体功能，但其在骨骼生物学中的生理作用，特别是在成骨细胞分化及骨代谢中的功能，几乎完全未知。此外，尽管TRMT10C人类突变会导致严重的线粒体疾病甚至早期致死，其在骨组织中的表达模式、调控机制及治疗潜力尚待阐明。基于此，研究人员开展了相关研究，以期揭示TRMT10C在骨代谢中的功能并探索其作为骨质疏松症治疗靶点的可能性，论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

**关键技术方法**

本研究采用Cyagen公司购买的Trmt10c-flox小鼠与Biocytogen公司购买的Osx-Cre小鼠杂交构建成骨祖细胞特异性条件性基因敲除模型；利用增强型交联免疫沉淀高通量测序（eCLIP-seq）结合m¹A-MAP测序鉴定TRMT10C结合的RNA靶点及其调控的m¹A修饰位点；通过PASSer算法预测TRMT10C别构位点，采用Schrodinger Suite中Glide模块进行高通量虚拟筛选（HTVS）、标准精度（SP）和额外精度（XP）对接，结合MM/GBSA结合自由能计算进行多阶段虚拟筛选，经功能验证获得小分子激动剂；运用细胞热位移分析（CETSA）和表面等离子体共振（SPR）验证小分子与TRMT10C的直接结合；采用micro-CT三维重建、ABH/OG及TRAP组织学染色、动态骨组织形态计量学（钙黄绿素双标记）及血清ELISA检测骨转换标志物（PINP、CTX-1、ACP5）；利用12周龄雌性C57BL/6小鼠去卵巢（OVX）模型（8周给药）和12月龄雄性C57BL/6小鼠衰老模型（10周给药）评估TM3体内治疗效应。

**研究结果**

**TRMT10C促进成骨分化并在骨质疏松症中下调**：通过RT-qPCR、Western Blot、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）染色及骨质疏松症患者来源BMSCs样本分析，发现TRMT10C mRNA在颅骨和长骨中高表达，其蛋白水平在BMSCs成骨分化过程中逐渐升高，而在去卵巢（OVX）和老年小鼠骨小梁表面TRMT10C阳性成骨细胞数量显著减少，骨质疏松症患者BMSCs中TRMT10C表达亦显著低于健康对照；功能实验证实TRMT10C过表达增强碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色及Runx2、Osx、ALP和骨钙素（OCN）等成骨标志物表达，而敲低则显著抑制成骨分化。

**TRMT10C调控线粒体核糖核酸酶P活性并催化mt-rRNA/tRNA的m¹A修饰**：通过Trmt10c敲低实验、R176L（核糖核酸酶P活性缺陷）和D309N（甲基转移酶活性缺陷）点突变救援实验、eCLIP-seq和m¹A-MAP-seq分析，发现TRMT10C敲低导致OXPHOS亚基的mRNA和蛋白水平显著降低，伴有未加工线粒体转录前体的积累；eCLIP-seq证实TRMT10C可结合mt-rRNA（2个，4个峰）、mt-tRNA（6个，16个峰）和mt-mRNA；m¹A-MAP-seq显示TRMT10C敲低导致24个mt-rRNA位点m¹A修饰下调（包括ChrM:1882、ChrM:1862和ChrM:1895等位点），而mt-tRNA的m¹A水平保持稳定，揭示TRMT10C催化mt-rRNA m¹A修饰的新功能。

**Trmt10c缺失导致生长发育迟缓和骨量减少**：通过构建Osx-Cre;Trmt10c^fl/fl条件性敲除小鼠并进行骨骼整体茜素红/阿尔新蓝染色、X射线、micro-CT三维重建、股骨三点弯曲力学测试、ABH/OG组织学染色及动态骨组织形态计量学分析，发现突变小鼠出现生长发育迟缓、牙齿异常、多发骨折、骨强度显著降低；μCT分析显示骨小梁和皮质骨量、骨密度显著减少；组织学显示成骨细胞数量减少、骨髓脂肪细胞数量和面积增加；动态参数包括矿化沉积率（MAR）、矿化表面/骨表面比（MS/BS）和骨形成率/骨表面比（BFR/BS）均显著降低。骨吸收方面，通过骨髓单核细胞体外破骨分化诱导、血清ELISA及组织TRAP染色，发现破骨细胞分化减弱，血清CTX1和ACP5降低，破骨细胞数量减少，RANKL和OPG表达降低但RANKL/OPG比值下降。

**TRMT10C激动剂筛选和功能验证**：针对TRMT10C的冷冻电镜结构（PDB: 7ONU）、晶体结构（PDB: 5NFJ）和AlphaFold预测全长模型，通过PASSer预测四个高置信度别构口袋，对超过1,000,000个化合物进行多阶段虚拟筛选，前100名经MM/GBSA优化后选择30个进行实验验证。基于CYTB蛋白表达初筛获得6个先导化合物，再经OXPHOS亚基面板（ND1-ND6、CYTB、COX1-COX3、ATP6、ATP8）Western Blot分析确定TM3为最优激动剂，最佳工作浓度为10 nM。CETSA显示TM3显著提高TRMT10C蛋白热稳定性，SPR测定其与纯化重组TRMT10C蛋白的直接结合解离常数（K_d）为2.6 μM。药代动力学显示TM3半衰期T_1/2=1.53 h，C_max=7.3 μM（2 mg/kg）；50 μg/kg剂量下C_max=0.19 μM。急性毒性实验（最高100 mg/kg，3天）显示体重、肝肾功能、血液学参数及主要脏器组织学均无异常。

**TRMT10C激动剂促进成骨分化并防治骨质疏松症**：通过体外成骨分化实验及基因敲除验证，发现TM3增强小鼠和人体BMSCs成骨分化，但该效应在Osx-Cre;Trmt10c^fl/fl来源BMSCs中消失。在OVX模型（50 μg/kg/d腹腔注射，8周）中，TM3显著增加骨组织m¹A和OXPHOS亚基表达，μCT显示骨小梁骨量和骨密度显著增加，组织学显示成骨细胞和破骨细胞数量增加、脂肪细胞减少，动态骨形成参数（MAR、MS/BS、BFR/BS）升高，血清PINP、CTX-1和ACP5均升高。在12月龄雄性衰老模型（50 μg/kg/d，10周）中，TM3同样显著改善年龄相关骨丢失，增加骨量和骨密度，提升骨形成和骨吸收标志物，减少骨髓脂肪；但体重有所降低，且对皮质骨量和骨密度的增加效应有限。

**讨论与结论**

讨论部分指出，线粒体在能量需求高的成骨细胞中至关重要。BMSCs未分化时主要依赖糖酵解，而成骨分化后OXPHOS成为主要能量来源，这与Wnt7b驱动的糖酵解重编程不同。Trmt10c条件性敲除小鼠（Osx-Cre;Trmt10c^fl/fl）与Prx1-Cre;Tfam^fl/fl小鼠表型相似，均呈现肢体缩短和骨折，提示TRMT10C缺失模拟了更广泛的线粒体OXPHOS缺陷。骨髓脂肪积累可能源于Osx-Cre不仅靶向成骨祖细胞，还可标记部分骨髓间充质干/祖细胞，使其向脂肪等间充质谱系分化；同时成骨与成脂之间存在谱系竞争。本研究扩展了TRMT10C的功能认知，证实其除催化mt-tRNA和mt-mRNA的m¹A修饰外，还可催化mt-rRNA的m¹A修饰，且其促进OXPHOS亚基表达不依赖于mt-mRNA的m¹A修饰。通过结构虚拟筛选获得的别构激动剂TM3在OVX和衰老模型中有效减轻骨丢失，但因年龄相关TRMT10C和OXPHOS活性下降，对老龄小鼠皮质骨效果有限；且TM3同时增强骨形成和骨吸收，呈现高骨转换治疗特征。此外，TRMT10C与miRNA、snoRNA、细胞质rRNA及假基因转录本的广泛相互作用有待未来研究。

本研究结论中，研究人员确立了TRMT10C作为骨获取和稳态的关键调控因子，其通过促进线粒体RNA加工和m¹A依赖性表观转录组调控，上调OXPHOS亚基表达，增加氧化磷酸化和ATP产生，最终支持氧化磷酸化依赖性细胞程序，包括成骨分化和细胞增殖。此外，小分子激动剂TM3的鉴定为通过靶向激活TRMT10C缓解骨质疏松症提供了有前景的治疗化合物和靶点。