《Scientific Reports》：METTL7A is a key regulator of hepatic lipid metabolism and nonalcoholic fatty liver disease progression
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摘要：甲基转移酶样蛋白7A（Methyltransferase-like protein 7A，METTL7A）是一种富集于肝细胞的m6A RNA甲基转移酶及硫醇甲基转移酶（thiol methyltransferase），既往被认为参与肿瘤生物学过程，但其在
摘要：甲基转移酶样蛋白7A（Methyltransferase-like protein 7A，METTL7A）是一种富集于肝细胞的m6A RNA甲基转移酶及硫醇甲基转移酶（thiol methyltransferase），既往被认为参与肿瘤生物学过程，但其在肝脏脂质代谢及非酒精性脂肪性肝病（代谢功能障碍相关脂肪性肝病，MASLD/NAFLD）中的作用尚不清楚。研究人员采用油酸（oleic acid，OA）诱导HepG2及Huh7细胞建立肝细胞脂肪变性模型，通过shRNA介导的敲低、RNA测序、脂质代谢检测及回补实验探讨METTL7A的功能，经质谱及免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）分析蛋白相互作用，并利用尾静脉注射rAAV2/8-shMETTL7A的高脂饮食（high-fat diet，HFD）小鼠MASLD/NAFLD模型进行体内验证。结果显示，OA诱导的脂肪变性肝细胞中METTL7A表达显著上调；沉默METTL7A可减轻脂质蓄积、改善细胞活力、降低低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平并升高高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。转录组学分析鉴定围脂滴蛋白5（Perilipin 5，PLIN5）为METTL7A敲低后显著下调的关键下游靶基因。机制上，METTL7A敲低抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/AKT，PI3K/AKT）通路活化并下调PLIN5表达。质谱鉴定分离蛋白2（separation protein in cones and discs 2，SAPCD2）为METTL7A互作蛋白，在METTL7A缺陷细胞中过表达SAPCD2可恢复脂质蓄积、PI3K/AKT通路活化及PLIN5水平。体内实验中，AAV介导的肝脏METTL7A敲低减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性，使血清脂质谱及肝损伤标志物正常化，并降低肝脏SAPCD2、PLIN5、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）表达，同时升高激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）表达。综上，METTL7A是此前未被认识的肝脏脂质稳态调控因子，通过维持SAPCD2表达并激活PI3K/AKT通路及上调PLIN5促进肝细胞脂肪变性。靶向METTL7A可能是MASLD/NAFLD的潜在治疗策略。
论文解读：《METTL7A是肝脏脂质代谢及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD/MASLD）进展的关键调控因子》
本研究发表于Scientific Reports。代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD/NAFLD；旧称非酒精性脂肪性肝病，nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球最常见的慢性肝病之一，可进展为非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH/MASH）、纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。目前MASLD/NAFLD尚无美国FDA批准的有效靶向药物，标准治疗依赖生活方式干预。肝脂肪变性的核心是肝细胞脂肪酸摄取与从头脂生成（de novo lipogenesis，DNL）超过脂肪酸氧化及输出。PI3K/AKT通路、ACC、FAS及HSL等分子参与此过程，但调控网络尚未完全阐明。甲基转移酶样蛋白7A（METTL7A）是肝细胞高表达的m6A RNA甲基转移酶及硫醇甲基转移酶，在肿瘤中被报道，但其在肝脏脂质代谢及MASLD/NAFLD中的作用未见研究。因此，研究人员旨在明确METTL7A在肝细胞脂肪变性中的功能及分子机制。
主要关键技术方法
研究人员采用OA诱导人肝癌HepG2及Huh7细胞建立体外脂肪变性模型，通过慢病毒/shRNA敲低及过表达载体进行功能获得/缺失实验；利用油红O（Oil Red O）染色及生化试剂盒检测细胞内及血清脂质谱[总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）]和肝酶[谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）]；通过RNA测序（RNA-seq）筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）；实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）及蛋白质印迹法（Western blot）检测基因及蛋白表达；免疫共沉淀（Co-IP）及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴定METTL7A互作蛋白；构建尾静脉注射rAAV2/8-shMETTL7A的高脂饮食（HFD）诱导C57BL/6J雌性小鼠MASLD/NAFLD模型进行体内验证。
研究结果
METTL7A expression is upregulated in an MASLD/NAFLD cellular model（METTL7A在MASLD/NAFLD细胞模型中表达上调）
研究人员用不同浓度OA处理HepG2（1 mM）和Huh7（200 μM）细胞24 h，经MTT法确定无毒性浓度，Oil Red O染色证实成功建立脂肪变性模型。qPCR及Western blot显示OA处理显著上调两种肝细胞中METTL7A的mRNA及蛋白水平，提示METTL7A可能参与肝细胞脂质蓄积过程。
METTL7A knockdown mitigates lipid accumulation in OA-treated HCC cells（METTL7A敲低减轻OA处理肝癌细胞中的脂质蓄积）
研究人员构建三种shMETTL7A并筛选出敲低效率最高的shMETTL7A-1。在OA处理的HepG2及Huh7细胞中敲低METTL7A后，Oil Red O染色显示脂滴明显减少，MTT法显示细胞活力部分恢复；生化检测示LDL-C、TC、TG降低，HDL-C升高；qPCR及Western blot证实METTL7A敲低下调脂生成相关酶ACC和FAS，上调脂解酶HSL。表明METTL7A是肝细胞脂质蓄积的正向调控因子。
Depletion of METTL7A causes reduced expression of PLIN5 and blocks the activation of the PI3K/AKT pathway（METTL7A耗竭降低PLIN5表达并阻断PI3K/AKT通路活化）
对OA处理的对照及METTL7A敲低HepG2细胞行RNA-seq，筛选出受METTL7A调控且已知参与肝脏脂质代谢的PLIN5（Perilipin 5，围脂滴蛋白5）。qPCR及Western blot验证METTL7A敲低后PLIN5显著下调（PLIN5本身也受OA诱导上调）。同时Western blot显示OA可激活PI3K/AKT通路（p-PI3K及p-AKT升高），而METTL7A敲低取消此激活效应。说明METTL7A通过上调PLIN5及激活PI3K/AKT通路促进脂质沉积。
METTL7A interacts with SAPCD2 in HCC cells（METTL7A与SAPCD2在肝癌细胞中相互作用）
为探究METTL7A如何调控PI3K/AKT及PLIN5，研究人员对Flag-METTL7A过表达细胞进行质谱互作组分析并结合PLIN5互作蛋白数据库筛选，鉴定分离蛋白2（SAPCD2，separation protein in cones and discs 2）为候选互作蛋白。外源及内源Co-IP均证实METTL7A与SAPCD2物理结合；qPCR及Western blot显示METTL7A敲低后SAPCD2表达显著降低，提示METTL7A维持SAPCD2的表达水平。
SAPCD2 is required for OA-induced PI3K/AKT activation and PLIN5 expression（SAPCD2是OA诱导PI3K/AKT活化及PLIN5表达所必需的）
单独敲低SAPCD2可抑制OA诱导的p-PI3K/p-AKT升高及PLIN5上调（不影响METTL7A），而过表达SAPCD2进一步增强PI3K/AKT磷酸化及PLIN5水平；Oil Red O染色示SAPCD2敲低减轻、过表达加重脂质蓄积。表明SAPCD2位于METTL7A下游，介导OA诱导的PI3K/AKT活化及PLIN5表达。
Overexpression of SAPCD2 rescues lipid accumulation in OA-treated HCC cells with METTL7A deficiency（SAPCD2过表达回补METTL7A缺陷OA处理肝癌细胞中的脂质蓄积）
在METTL7A敲低的OA处理细胞中过表达SAPCD2，Oil Red O染色见脂质蓄积恢复，细胞活力下降，生化指标示LDL-C/TC/TG回升、HDL-C降低；qPCR及Western blot显示PLIN5、FAS、ACC上调，HSL下调，PI3K/AKT磷酸化恢复。证实SAPCD2是METTL7A促脂生成作用的关键介质。
METTL7A knockdown alleviates HFD-induced hepatic steatosis in MASLD/NAFLD mice（METTL7A敲低减轻HFD诱导的MASLD/NAFLD小鼠肝脏脂肪变性）
以尾静脉注射rAAV2/8-shMETTL7A靶向敲低C57BL/6J雌鼠肝脏METTL7A，联合HFD喂养2个月建立体内模型。模型组肝脏苍白伴严重脂肪变性（H&E及Oil Red O染色），shMETTL7A组肝脏色泽接近正常、脂滴显著减少；血清LDL-C、TC、TG、AST、ALT降低，HDL-C升高；肝组织qPCR及Western blot证实METTL7A敲低，伴随SAPCD2、PLIN5、FAS、ACC下调，HSL上调，PI3K/AKT磷酸化受抑。体内实验验证了METTL7A促进肝脏脂肪变性的功能。
讨论与结论总结
讨论指出本研究首次揭示METTL7A是肝脏脂质稳态的新调控因子，在OA或HFD诱导的脂肪负荷下表达升高并促进脂肪变性。其机制为METTL7A与SAPCD2互作并维持其表达，进而激活PI3K/AKT信号，上调PLIN5，促进脂生成酶FAS/ACC表达并抑制脂解酶HSL，最终驱动肝细胞脂质储存。METTL7A在脂质负荷下上调的机制（如miRNA或DNA甲基化调控）及其m6A甲基转移酶活性或支架功能的具体贡献尚需进一步研究，METTL7A在MASH/NASH及纤维化阶段的作用亦待探索。临床前数据显示靶向METTL7A可改善肝脂肪变性与血脂紊乱，提示其可作为MASLD/NAFLD的潜在治疗靶点。
结论（翻译）： 综上所述，本研究鉴定METTL7A为肝脏脂质稳态的新型调控因子。机制上，METTL7A与SAPCD2互作以维持其表达，从而激活PI3K/AKT通路并促进PLIN5介导的脂质储存。结果表明METTL7A可作为MASLD/NAFLD的潜在治疗靶点。未来需进一步研究靶向METTL7A在更晚期疾病阶段（包括MASH/NASH及纤维化）的治疗效益。
