发育过程中动态变化且不发生趋同的精神分裂症风险CNV模型转录组特征

《Molecular Psychiatry》：Developmentally dynamic, non-convergent transcriptomic profiles in CNV models for schizophrenia risk

　　

精神分裂症是一种复杂的精神障碍，具有显著的遗传异质性和临床异质性。尽管已经鉴定出许多与精神分裂症高风险相关的罕见拷贝数变异（copy number variations，CNVs），但这些变异在基因内容或功能上并无明显重叠。研究人员提出假设：精神分裂症相关CNV的下游效应会在共享的分子通路上发生趋同。为检验这一假设，研究人员对5种精神分裂症相关CNV小鼠模型——15q13.3del、3q29del、1q21.1del、22q11.2del和16p11.2dup——的前额叶皮层，在青春后期和成年期两个发育阶段进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）分析。基于292,943个高质量单细胞转录组，研究人员在每一种模型中鉴定出随年龄和细胞类型而变化的差异基因表达模式及生物学通路扰动。结果显示，这些CNV并未在共同的分子机制上趋同，而是以发育动态方式影响各自独特的细胞通路。值得注意的是，在15q13.3del和16p11.2dup模型的皮层深层皮质-丘脑投射神经元中，以及成年22q11.2del小鼠的端脑内投射神经元中，失调基因表现出精神分裂症SNP遗传力富集。上述结果支持一种模型：罕见CNV是通过发育过程中动态变化且彼此不同的通路，而非通过共享的分子机制，参与精神分裂症的遗传风险形成。

该论文发表于《Molecular Psychiatry》，聚焦精神分裂症相关罕见拷贝数变异（copy number variations，CNVs）在脑内分子层面的共同性问题。精神分裂症是一种高度复杂的精神障碍，其遗传结构具有明显多基因性，常见单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）、罕见CNV以及罕见单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）均可共同增加患病风险。尽管基因组学研究已识别出多类高风险CNV，但不同CNV所覆盖的基因内容及功能并不一致，因此长期存在一个核心问题：这些不同的遗传打击是否会在下游神经生物学层面汇聚到共同机制。由于携带精神分裂症相关CNV的患者在人群中占比很低，人脑尸检样本稀缺，研究人员因而借助动物模型与单细胞组学技术，尝试在与疾病起病密切相关的青春后期至成年早期这一关键发育窗口中，解析遗传风险如何影响前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）的细胞状态与转录程序。开展该研究的意义在于，它有助于回答精神分裂症遗传异质性与疾病生物学之间如何衔接这一基础问题，并评估不同高风险CNV是否共享可解释疾病易感性的转录组学基础。

研究人员选取5种精神分裂症相关CNV小鼠模型，即15q13.3del、3q29del、1q21.1del、22q11.2del和16p11.2dup，均维持于C57BL/6N遗传背景，在出生后第40天（P40，青春后期）和第70天（P70，成年早期）采集前额叶皮层，纳入80只小鼠，每种CNV模型包括8只突变体和8只同窝对照。研究采用配对实验设计与10x Genomics平台单细胞RNA测序（scRNA-seq），结合Scanpy聚类注释、细胞组成分析、负二项广义线性混合模型（negative binomial generalized linear mixed model）差异表达分析、基因本体（gene ontology，GO）富集、Human Phenotype Ontology分析、分层连锁不平衡评分回归（stratified linkage disequilibrium score regression，S-LDSC）以及与人类尸检脑转录组和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）类器官数据的重叠分析，以系统比较不同CNV模型在细胞类型和年龄维度上的转录组改变。

研究结果部分首先显示，数据集经严格质控后获得292,943个高质量单细胞转录组，识别出25种主要细胞类型，包括非神经元细胞、兴奋性投射神经元和抑制性中间神经元。细胞组成分析表明，只有22q11.2del模型出现显著的小胶质细胞比例升高，而其余模型的细胞类型构成总体稳定；分年龄分析进一步发现，成年22q11.2del小鼠的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）比例升高。由于各模型之间并不存在共享的细胞丰度变化模式，研究人员据此认为，前额叶皮层细胞组成改变不太可能是这些CNV共同导致精神分裂症风险的统一基础。

在“Differential gene expression across models”部分，研究人员利用负二项广义线性混合模型开展差异表达分析，并以CNV区间内基因为内部参照检验分析性能。结果显示，所有缺失模型在CNV位点内大多数转录本表达降低，而重复模型中相应转录本表达升高，且CNV区间外1 Mb范围内未见显著顺式效应，说明转录扰动主要局限于特定基因组区域。不同CNV对基因表达的影响具有鲜明的细胞类型特异性和模型特异性。总体上，谷氨酸能神经元（glutamatergic neurons）是受影响最广泛的细胞类别，其中第6层皮质-丘脑投射神经元（layer 6 corticothalamic projection neurons，L6 CT neurons）在1q21.1del、15q13.3del和16p11.2dup模型中受到的影响尤为突出；此外，3q29del中的小胶质细胞和22q11.2del中的分化承诺型少突胶质前体细胞（Oligo Enpp6）则呈现强烈而独特的扰动。这些发现表明，不同CNV会在不同细胞群中引发各异的转录应答，而非沿同一细胞路径产生共性改变。

在“Crosstalk between CNV loci, rare and common variants”部分，研究人员考察了不同CNV位点之间是否存在表达层面的“串扰”，并分析差异表达基因与人类罕见编码变异及常见风险变异之间的关系。结果显示，尽管个别模型中可见其他CNV位点基因的差异表达，但总体数量并未高于随机预期，说明不同CNV位点之间缺乏系统性的转录串扰。对于人类精神分裂症相关罕见编码变异同源基因，虽然部分基因在若干细胞类型中表现失调，尤其见于谷氨酸能神经元，但其富集程度同样未超过偶然水平。然而，S-LDSC分析揭示了更具疾病相关性的信号：在具有足够SNP覆盖的细胞类型特异性差异表达基因集中，15q13.3del和16p11.2dup模型的L6 CT神经元表现出精神分裂症SNP遗传力富集；与此同时，15q13.3del和16p11.2dup模型的这一细胞群还显示与智力相关SNP的富集。功能富集分析进一步表明，16p11.2dup模型L6 CT神经元的差异基因主要涉及神经元分化、前体代谢物与能量生成以及程序性细胞死亡调控；15q13.3del模型L6 CT神经元则富集于突触信号传递、突触组织和神经发生。15q13.3del中这些差异基因还富集于癫痫、脑电图异常、重复动作和攻击行为等Human Phenotype Ontology条目，提示同一细胞类型可能同时关联精神分裂症风险与15q13.3缺失综合征中的神经行为异常。

在“Analysis of convergence of DEGs across models”部分，研究人员直接评估不同CNV模型之间差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的重叠程度。结果显示，全部已识别DEG中有97%不与任何其他模型共享，说明各模型转录扰动高度独特。例外仅见于L6 CT神经元，其中15q13.3del与3q29del共享124个DEG，且显著高于随机预期，这些共享基因主要关联突触信号和神经元发育过程。进一步基于各细胞类型前100个最显著DEG的log₂倍数变化进行Pearson相关和层次聚类后发现，在谷氨酸能神经元和GABA能中间神经元中，转录变化主要按CNV模型而非按同类细胞亚型聚类，提示同一模型内不同细胞的转录扰动模式反而比不同模型中同类细胞更相近。16p11.2dup与1q21.1del形成一组，22q11.2del与3q29del形成另一组，且两组之间呈中度负相关；15q13.3del则构成独立分支。上述结果进一步强化了这样一个结论：精神分裂症相关CNV在转录组层面缺乏广泛趋同，而是形成模型依赖的特异表达谱。

在“Convergence on the level of biological pathways”部分，研究人员进一步检验不同模型虽缺少共享DEG，是否仍可能在生物通路层面趋同。通过对上调和下调DEG进行GO富集，并以语义相似性比较不同细胞类型和模型的GO条目集合，结果发现大多数富集通路同样具有细胞类型特异性和CNV模型特异性，几乎没有跨模型共享的生物过程。例如，16p11.2dup模型的内皮细胞上调血管发育和形态发生相关过程，这一现象在其他模型中未见。尽管整体上以差异性为主，仍观察到少数局部相似性：15q13.3del模型的小胶质细胞与16p11.2dup模型的少突胶质细胞均下调与细胞质翻译相关的过程，其驱动因素均为核糖体基因下调，提示这些细胞中的蛋白质合成受到抑制；3q29del模型中星形胶质细胞与L4/5端脑内投射神经元（intratelencephalic neurons，IT neurons）则共同表现出ATP与核苷酸合成、翻译、呼吸链复合体装配和能量生成等代谢过程上调。总体而言，通路层面的分析并未支持五种CNV在共同分子程序上的明显汇聚。

在“Transcriptional alterations are developmentally dynamic”部分，研究人员将青春后期与成年早期分开分析，以评估CNV相关转录失调在发育过程中的动态演变。大多数模型在成年早期检测到更多DEG，提示转录失调随年龄加重。22q11.2del模型最具代表性：联合分析时Oligo Enpp6似乎是受影响最强的细胞类型，但分年龄分析显示，兴奋性神经元和其他非神经元细胞在年龄特异分析中信号更强。进一步比较两个年龄阶段DEG的log₂倍数变化可见，22q11.2del模型在多数受扰细胞类型中呈年龄间负相关，即青春后期与成年早期的失调方向相反，只有Oligo Enpp6不是如此。这说明22q11.2del在青春期向成年过渡时发生了显著的转录组重塑，而这一重塑在合并年龄分析时会被掩盖。遗传力富集分析进一步显示，22q11.2del模型中仅成年早期、而非青春后期的失调基因富集精神分裂症风险；16p11.2dup也表现出较弱的类似趋势。成年22q11.2del小鼠中，多类兴奋性神经元和星形胶质细胞的DEG还富集于ADHD、ASD及智力相关SNP。对于与精神分裂症相关的关键DEG及其GO条目，15q13.3del模型L6 CT神经元在青春后期主要表现为钙离子输入、神经元突起发育与形态发生、囊泡介导转运等过程广泛下调，而成年早期则转为更聚焦的信号通路损害；与之相对，22q11.2del模型L4/5 IT神经元在青春后期改变较聚焦，但成年早期出现更广泛的细胞通讯、细胞运动和囊泡转运下调。这表明，成年转换期尤其是22q11.2缺失背景下，是谷氨酸能神经元功能以精神分裂症相关方式受损的重要易感窗口。

研究人员随后将本研究DEG集与精神分裂症患者尸检脑组织的bulk RNA-seq和单核RNA测序（single-nuclei RNA-seq，snRNA-seq）结果，以及CNV综合征来源iPSC皮层类器官数据进行比较。尽管不同CNV小鼠模型之间DEG重叠很少，大多数模型却与精神分裂症患者尸检脑组织中的失调基因呈显著重叠，且涉及多个不同细胞类型。这说明，来源各异的遗传风险变异虽通过不同的转录路径起作用，但其部分结果能够重现人类精神分裂症脑组织中的转录异常表型。与CNV类器官模型的重叠较少，研究人员认为这可能与类器官发育成熟度与本研究所用青春后期和成年小鼠皮层之间存在差异有关。

讨论部分强调，本研究最初假设不同精神分裂症相关CNV可能在关键细胞类型中收敛为共同的基因表达变化或生物过程，但结果并不支持这一设想。相反，五种CNV模型在DEG和失调通路层面均显示最小程度的重叠，提示精神分裂症相关罕见CNV在转录组层面主要通过彼此不同的机制起作用。这一结论对“不同高风险CNV共享共同分子通路”的观点提出挑战。不过，研究也识别出相对一致易受累的细胞群，即兴奋性神经元，尤其是深层兴奋性投射神经元。L6 CT神经元在1q21.1del、16p11.2dup和15q13.3del模型中受影响突出，且后两者的相关基因集以及成年22q11.2del中的相关细胞群都表现出精神分裂症遗传力富集。这一结果与人脑尸检研究中深层兴奋性神经元参与精神分裂症病理的证据相呼应，但同时也指出，即便某些神经元群体可能是共同脆弱点，不同遗传打击通向功能失调的分子路线仍然不同。

研究还显示，转录失调的时间维度具有重要意义。16p11.2dup和22q11.2del模型的失调随年龄加剧，而其余模型呈现更混合的模式；尤其22q11.2del在青春后期与成年早期之间出现方向相反的表达变化，提示该模型存在显著发育转换。结合其成年早期DEG富集精神分裂症遗传力且集中指向突触信号过程，研究支持这样一个认识：22q11.2缺失背景下，从青春期向成年过渡的发育窗口对精神分裂症风险尤为关键。

研究结论部分可概括为：精神分裂症相关CNV在基础状态下并不在分子层面发生趋同，而是产生具有年龄特异性和细胞类型特异性的疾病相关转录组效应。研究结果强调了发育时序的重要性，支持深层兴奋性神经元可能在疾病风险中发挥作用，并突出了动物模型在解析青春期发育过程中细胞脆弱性方面的价值。不同CNV是否会在应激条件下或在转录组以外的其他生物学层级上出现趋同，仍是一个重要且尚待回答的问题。