F/HN假型慢病毒载体经静脉递送后在小鼠中的评估

《Gene Therapy》：Assessment of F/HN-pseudotyped lentiviral vector following intravenous delivery to mice

　　

为了寻求一种能有效转导肺部的基因转移载体，英国呼吸基因治疗联盟开发了一种慢病毒载体，该载体假型化自仙台病毒（Sendai virus, SeV）的包膜蛋白F和HN（rSIV.F/HN）。与其他病毒载体相比，单次给药的肺部rSIV.F/HN递送可在肺部和体循环中实现持续基因表达（小鼠约2年）。在此，研究人员探索了rSIV.F/HN载体平台在更广泛适应症中的应用，包括需要血清表达治疗性蛋白的系统性疾病。为评估rSIV.F/HN产生系统蛋白的潜力，研究人员对静脉载体递送进行了表征，并与通过“鼻嗅”实现的肺内给药进行了比较。两种递送途径均实现了分泌性报告蛋白Gaussia荧光素酶（Gaussia luciferase, GLux）的持续（至少1年）系统表达。系统rSIV.F/HN递送导致多个器官的广泛蛋白表达，同时产生了限制载体再给药的重要抗载体中和抗体（neutralising antibodies, NAbs）。相反，肺内给药后观察到局部气道转导，研究人员此前已证明这并不妨碍有效的载体再给药。这些数据支持肺内rSIV.F/HN递送用于系统蛋白生产，可实现持续的高水平转基因表达和可行的再给药。

**论文解读：F/HN假型慢病毒载体用于系统蛋白生产的递送途径比较**

**研究背景与问题**

基因治疗需要高效的基因转移载体（GTA），以实现靶细胞中缺陷蛋白的恢复表达。英国呼吸基因治疗联盟开发的慢病毒载体rSIV.F/HN，假型化自仙台病毒（SeV）的F和HN包膜蛋白，在肺部转导中展现出独特优势：单次肺内给药可实现肺部及体循环中长达约2年的持续基因表达，且能高效转导多种肺上皮细胞类型，包括终末分化细胞和具有自我更新能力的肺泡II型细胞。然而，大多数针对系统性先天性疾病（如血友病）的基因治疗临床试验采用静脉递送途径，例如基于AAV的基因治疗已获许可（Roctavian和Hemgenix），但AAV载体因基因组主要保持游离态而无法实现持续性治疗水平蛋白表达，且静脉递送后产生的中和抗体（NAbs）长期存在，导致重复给药不可行。此外，前期研究已初步证明肺内递送rSIV.F/HN可产生分泌性蛋白并进入血液循环。因此，有必要系统评估静脉递送rSIV.F/HN的潜力，并与肺内递送进行比较，以确定其在不同适应症（尤其是需要系统蛋白表达的系统性疾病）中的适用性。

**研究内容与结论**

研究人员通过给小鼠（C57BL/6）单次静脉或肺内（鼻嗅法）递送编码分泌性报告蛋白Gaussia荧光素酶（GLux）的rSIV.F/HN载体，比较了两种途径的血清蛋白表达持续性和效率；利用编码萤火虫荧光素酶/EGFP融合蛋白（EGFPLux）的载体评估生物分布；并检测了重复静脉给药后的转导效率和免疫反应。结论如下：单次静脉递送rSIV.F/HN可实现至少12个月的持续系统蛋白表达，但最高剂量下静脉途径的转导效率显著优于肺内途径；静脉递导致使载体广泛分布于肺、肝、脾等多器官，而肺内递送仅限于胸腔内；重复静脉给药后，转导效率降至背景水平，伴随显著升高的抗载体NAbs（中位数滴度达最大检测限1/6400），表明静脉重复给药不可行。相反，肺内递送此前已被证明可重复给药而不损失效率。这些数据支持肺内rSIV.F/HN递送用于系统蛋白生产，因其可实现持续高表达和可行重复给药。论文发表在《Gene Therapy》。

**主要技术方法**

1. **载体生产与滴定**：通过瞬时转染HEK293T细胞（悬浮培养）生产rSIV.F/HN载体，采用阴离子交换色谱和切向流过滤纯化，以TSSM缓冲液配制。功能滴定通过qPCR检测WPRE序列计算转导单位（TU/ml）。
2. **动物模型与给药**：8-10周龄C57BL/6小鼠（雌雄均有，购自Charles Rivers Laboratories），随机分组。肺内给药通过异氟烷麻醉下鼻嗅法（100 μl/剂量），静脉给药通过尾静脉注射（25 G胰岛素针）。样本队列包括GLux持续时间研究（每剂量组n=6）和生物分布研究（静脉组n=8，肺内组n=6，未转导组n=5）。
3. **GLux表达检测**：血清样本经尾静脉穿刺采集（1、2、5、12、24、52周），使用Pierce Gaussia Luciferase Flash Assay Kit检测发光信号（RLU）。
4. **生物分布分析**：35天后进行活体生物发光成像（IVIS Spectrum），腹腔注射VivoGlo Luciferin底物；随后解剖7种器官（肺、肝、脾、肾、心、脑、性腺），匀浆后定量萤火虫荧光素酶活性（RLU/mg总蛋白）。
5. **重复给药与免疫应答**：每月一次静脉注射，三剂量组先两次对照载体（rSIV.F/HN-mADAMTS13），末次为rSIV.F/HN-EGFPLux；单剂量组对照缓冲液后一次实验载体。中和抗体检测：血清与rSIV.F/HN-EGFP孵育后检测HEK293T细胞GFP阳性率，计算IC₅₀滴度。

**研究结果**

**“单次剂量后Gaussia荧光素酶系统表达稳定至少12个月”**
通过测量血清GLux水平（RLU），单次肺内或静脉递送rSIV.F/HN-GLux后，所有治疗组（低、中、高剂量）在52周内均显示持续表达，且无显著下降趋势。静脉递送最低剂量组（2.4e⁷ TU/小鼠）的GLux表达接近背景，而肺内递送同剂量可实现显著高于背景的表达。

**“最高治疗剂量下，rSIV.F/HN载体静脉递提供更高的转导效率”**
线性混合效应模型显示剂量和时间对血清表达有显著主效应，且剂量×递送途径交互作用显著。高中剂量（2.4e⁸ TU/小鼠）下，静脉途径的GLux水平在24周和52周均显著高于肺内途径（约10倍），而低剂量下肺内途径更优。中等剂量下两种途径无显著差异。

**“rSIV.F/HN静脉递导致广泛生物分布”**
活体成像和解剖器官成像显示，肺内递送后信号仅局限于鼻腔和肺部，而静脉递送后信号分布于下胸、腹部、鼻子和尾部。器官匀浆定量证实，静脉递送在肺、肝、脾中检测到显著高于未转导组的荧光素酶活性（肺和肝p<0.01，脾p<0.05），且肝和脾中表达显著高于肺内递送组；肺内递送组仅在肺中表达显著高于其他组（p<0.0001）。性腺中虽有个体低信号，但未达到统计学显著。

**“重复静脉给药后转导效率降低”**
每月一次重复静脉递送（三次）后，活体生物发光信号较单次组显著降低（AUC均值下降77%，p<0.05）。器官成像显示三剂量组无任何器官可检测信号；匀浆定量表明，三剂量组在肺、肝、脾中的荧光素酶活性与未转导组无显著差异，而单剂量组肺和脾显著高于未转导组。中和抗体检测显示，单次静脉后已出现可检测NAbs，多次给药后滴度显著升高（p<0.001），部分小鼠达到最大检测限（1/6400），表明强抗载体免疫反应抑制了重复转导。

**讨论与结论**

**讨论**：静脉递送rSIV.F/HN虽实现持续系统表达，但产生显著中和抗体，重复给药后表达消失，而肺内途径可避免此限制。系统递送的广泛生物分布提示潜在脱靶风险（如性腺），但肺内途径的局部性可保障安全性。静脉递送的高剂量需求可能源于载体在多个器官中的稀释效应。与AAV类似，单次静脉给药也可能具有长期疗效，但重复给药不可行。未来可探索组织特异性启动子（如肝特异性AAT启动子）或抑制吞噬作用的CD47整合策略，以提高靶器官效率和降低免疫原性。

**研究结论**（原文“In summary”段落翻译）：
综上所述，单次静脉递送rSIV.F/HN慢病毒载体成功实现了报告蛋白的持久和广泛表达。宽广的趋向性提示rSIV.F/HN载体在更广泛疾病适应症中的潜力，例如肺内皮呼吸疾病、血液病（包括凝血障碍）、感染性疾病和遗传代谢病等。除肺以外其他器官和组织的有效转导允许转基因选择的更大灵活性，包括那些编码能在肝脏等器官中更高效进行翻译后修饰的蛋白。重复静脉给药后产生的强抗载体反应表明，系统rSIV.F/HN递送可能不适用于需要终生转基因表达和重复给药的慢性疾病。然而，其他治疗性病毒载体如AAV同样局限于单次给药，但已显示出单次剂量后的长期疾病纠正效果。未来可研究组织特异性启动子以增强目标器官中的转基因表达。替代方案是利用肺部作为系统蛋白生产的工厂，这已在持续治疗性转基因血清表达和可行重复给药中得到证实。因此，肺内给药可能是一种更高效且更安全的递送方法，尤其适用于需要长期基因递送的疾病应用。