《Antioxidants》：Corchorus olitorius L. Protects Zebrafish Hair Cells Against Cisplatin-Induced Damage via Antioxidant and Anti-Apoptotic Mechanisms
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顺铂是一种广泛应用于临床的铂类化疗药物，常导致不可逆的毛细胞（hair cell）丢失，进而引起听力损伤。迄今，有效预防顺铂诱导耳毒性（ototoxicity）的策略仍然有限。黄麻（*Corchorus olitorius* L., COL）富含具有抗氧化和抗
顺铂是一种广泛应用于临床的铂类化疗药物，常导致不可逆的毛细胞（hair cell）丢失，进而引起听力损伤。迄今，有效预防顺铂诱导耳毒性（ototoxicity）的策略仍然有限。黄麻（*Corchorus olitorius* L., COL）富含具有抗氧化和抗炎活性的植物化学物，然而COL茎对顺铂诱导听力损失的保护作用尚未被探索。本研究旨在确定COL茎提取物处理是否能够减轻顺铂对斑马鱼侧线系统毛细胞的损伤。研究人员利用受精后7天（7-day post-fertilization, 7 dpf）的转基因斑马鱼幼鱼作为高通量筛选平台，评估COL茎提取物对顺铂诱导毛细胞损伤的保护作用。检测终点包括机械转导（mechanotransduction, MET）功能、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、凋亡和炎症反应，以及运动行为。同时评估了抗氧化能力和急性毒性。COL茎提取物预处理可维持毛细胞存活率、恢复MET功能、减少ROS累积、上调核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf-2）依赖性细胞保护基因、抑制凋亡，并减轻巨噬细胞浸润。游泳行为的恢复与毛细胞保护相关，确认了表型相关性。本研究首次证明COL茎通过抗氧化、抗凋亡和抗炎机制发挥强效的耳保护作用，有助于维持机械感觉功能和游泳行为。研究结果支持COL茎作为耳保护的有前景候选物，并验证了基于斑马鱼的高通量筛选在新治疗发现中的应用价值。
**研究背景与问题**
医源性听力损失是一种常见的听觉障碍，可在整个生命周期内发生，导致患者生活质量下降和社会经济负担加重。其病理基础主要与毛细胞的损伤或功能障碍相关，毛细胞在听觉感知中发挥关键作用。哺乳动物成熟耳蜗毛细胞在损伤后自发再生能力有限，导致不可逆的感音神经性听力损失。顺铂是目前临床肿瘤学中广泛使用的含铂、非细胞特异性化疗药物，用于治疗膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤。值得注意的是，顺铂诱导耳毒性的发生率约为50%，是一种严重的剂量限制性副作用，缺乏有效的预防策略，从而限制了其临床应用。顺铂耳毒性的机制尚未完全阐明，越来越多的证据表明，顺铂在内耳诱导的氧化应激通过ROS（活性氧）的产生介导耳毒性病理过程。因此，减少ROS累积并调节抗氧化通路可能成为预防顺铂诱导毛细胞丢失的有前景策略。
黄麻（*Corchorus olitorius* L., COL）属于锦葵科（Malvaceae），是一年生植物，主要在亚洲、非洲和中东地区种植，用于商业韧皮纤维生产。其嫩茎和叶作为可食蔬菜，在埃及和台湾等地区有民间草药应用。现有证据表明COL的不同部位（根、叶、种子和茎）富含生物活性成分，包括β-胡萝卜素、香豆素、离子酮糖苷、酚酸和黄酮类化合物，具有治疗发热、中暑、便秘、腹泻和膀胱炎的功效。关于COL衍生双咖啡酰奎宁酸的研究显示其通过靶向神经炎症小鼠模型中的促炎介质发挥神经保护作用。Zakaria等评估了COL对ICR小鼠痛觉反应的影响，结果显示COL具有显著的镇痛和抗炎特性。这些药理活性主要归因于其生物活性植物化学物的抗氧化特性。然而，关于COL有益作用的文献有限，有待进一步研究。天然来源的生物活性植物化学物已显示出显著的抗氧化活性，可增强内源性抗氧化防御机制并有助于疾病预防。迄今，COL对顺铂诱导耳毒性的保护作用尚未被探索。
**研究开展与结论**
基于上述背景，研究人员提出核心假设：COL提取物预处理可通过介导与抗氧化防御和抗炎反应相关的细胞通路来减轻顺铂诱导的毛细胞丢失。为验证该假设，本研究利用转基因斑马鱼幼虫建立高通量快速筛选平台，系统探究COL茎提取物的耳保护机制。
**关键技术方法**
研究样本来源于台湾台中市当地采集的COL新鲜茎部，经热水超声提取、过滤、浓缩和冻干制备提取物。植物化学分析采用福林-酚法（Folin-Ciocalteu法）和铝氯化物法分别测定总多酚和总黄酮含量；抗氧化活性通过2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除试验和Trolox等效抗氧化能力（TEAC）试验评估；化学成分鉴定采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UPLC-HRMS），在负离子电喷雾电离模式下进行，并与GNPS、MassBank和PlaSMA等公共数据库比对。实验动物使用（pvalb3b:TagGFP）转基因斑马鱼品系，该品系在侧线神经丘毛细胞中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）。毛细胞功能通过FM4-64染料标记评估；凋亡检测采用TUNEL法；巨噬细胞浸润通过中性红（NR）染色观察；ROS水平使用CellROX Orange试剂检测；抗氧化基因表达通过定量实时PCR（qPCR）分析，检测靶基因包括nrf-2、gpx（谷胱甘肽过氧化物酶1）、cat（过氧化氢酶）、gstp1（谷胱甘肽S-转移酶π 1）、sod2（超氧化物歧化酶2型）和sod1（超氧化物歧化酶1型）；行为学分析采用封闭腔室系统和EthoVision XT跟踪软件监测运动参数，包括移动距离、游泳速度、旋转频率和转弯角度。
**研究结果**
**植物化学含量与抗氧化活性评估**：COL茎提取物总多酚含量为7.43 ± 0.68 mg GAE/g DW（没食子酸当量/克干重），总黄酮含量为14.75 ± 2.52 mg CE/g DW（儿茶素当量/克干重）。DPPH法IC
50为6.19 ± 0.00 mg/mL，ABTS法IC
50为13.92 ± 0.00 mg/mL，TEAC值为142.35 ± 5.74 mg TEAC/g DW，表明其具有较强的抗氧化活性。
**COL茎提取物的化学成分鉴定**：UPLC-HRMS分析鉴定出八种主要代谢物，包括有机酸（苹果酸、柠檬酸、琥珀酸）、核苷（鸟苷）、二羧酸（壬二酸）和酚类化合物（绿原酸、隐绿原酸和洋蓟素）。
**COL茎对顺铂诱导毛细胞损伤的保护作用**：在0.5至3.0 mg/mL浓度范围内，COL茎提取物预处理均未显示急性毒性。与顺铂组相比，各浓度COL茎提取物预处理均显著增加毛细胞数量，最佳耳保护浓度为2.0 mg/mL（保护率达98.30%）。后续实验选用0.5、1.0和2.0 mg/mL三个浓度进行保护机制研究。
**COL茎对顺铂诱导凋亡和机械转导损伤的保护作用**：顺铂处理后FM4-64染料标记显示细胞膜标记丢失和细胞内吞减少，而COL茎提取物预处理恢复了FM4-64标记的膜增加，与毛细胞存活率趋势一致。TUNEL检测显示顺铂组侧线前区TUNEL阳性荧光颗粒显著增加，而COL茎提取物预处理呈剂量依赖性减少TUNEL阳性细胞。
**COL茎减轻顺铂诱导的氧化应激和炎症细胞浸润**：中性红染色显示，与对照组相比，顺铂组斑马鱼幼虫侧线神经丘中紫色颗粒显著积累，表明局部炎症和巨噬细胞浸润；COL茎提取物预处理显著减少顺铂诱导的巨噬细胞积累，呈剂量依赖性。CellROX染色显示顺铂处理触发神经丘内广泛而弥散的CellROX信号，表明氧化应激升高；COL茎提取物预处理有效减弱过度ROS产生。
**COL茎恢复顺铂诱导的抗氧化状态耗竭**：qPCR检测显示，顺铂处理后sod1、sod2、nrf-2、gstpi、gpx和cat表达显著降低，进一步证实ROS介导的毛细胞凋亡作用。COL茎提取物预处理逆转了顺铂损伤诱导的这些基因下调表达，表明其对顺铂耳毒性的保护作用。
**COL茎减轻顺铂诱导的斑马鱼游泳行为缺陷**：行为学分析显示，顺铂处理导致斑马鱼幼虫游泳行为受损，表现为移动距离、速度和旋转频率显著降低，转弯角度增加；COL茎提取物预处理逐渐恢复这些行为变化，呈剂量依赖性。刺激后5秒逃逸反应窗口（15-20秒）的分析趋势与整体行为分析一致。
**讨论总结与研究结论**
本研究首次提供了COL茎介导保护顺铂耳毒性机制通路的全面体内证据。研究人员实施高通量快速筛选策略，利用7 dpf斑马鱼幼虫作为筛选平台，系统研究了对顺铂介导耳毒性的多终点功能评估。
关于COL茎的化学成分，UPLC-HRMS分析确认COL茎提取物是酚类化合物的丰富来源，最显著为绿原酸、隐绿原酸和洋蓟素。这些植物化学物贡献了其抗氧化活性，DPPH和ABTS自由基清除方法显示COL茎提取物具有显著抗氧化活性，可能归因于这些植物化学物，提示其在减少ROS介导的凋亡中的潜在作用。急性毒性评估显示，COL茎提取物在高达3 mg/mL剂量下无明显毒性或死亡迹象。
顺铂耳毒性导致毛细胞存活率丧失。COL茎提取物在2 mg/mL时表现出最佳保护作用，将毛细胞存活率显著提高到接近对照组水平（98.3%）。在机械感觉毛细胞中，功能性机械转导（MET）通道对顺铂耳毒性是必需的。斑马鱼侧线毛细胞与哺乳动物内耳毛细胞共享纤毛MET过程，同样易受顺铂影响，顺铂在细胞质中快速积累并激活caspase依赖性凋亡信号。FM4-64染料评估MET通道功能完整性显示，顺铂暴露导致每神经丘毛细胞耗竭，伴随毛细胞中FM4-64荧光标记累积失败；COL茎提取物预处理有效恢复减弱的染料摄取，细胞体光学清晰度改善，在2 mg/mL时接近对照水平。
过度的ROS产生直接损害线粒体生物发生，造成DNA损伤，最终触发凋亡性毛细胞死亡。CellROX染色和TUNEL检测结果显示，COL茎提取物预处理抑制了ROS介导的凋亡级联反应，表现为神经丘中CellROX阳性橙色标记和TUNEL阳性信号的减少。此外，炎症作为顺铂诱导耳毒性的上游始动因素，主要涉及以巨噬细胞为主的吞噬细胞产生的免疫反应。COL茎提取物预处理减少侧线神经丘中巨噬细胞积累的效果，与降低的ROS水平和凋亡反应平行，验证了ROS驱动的炎症和凋亡级联的关键作用。
氧化应激与细胞抗氧化酶减少相关，过量ROS累积与线粒体生物发生功能障碍相关，并随后激活凋亡通路。研究发现过量ROS产生导致抗氧化酶相关基因表达耗竭，包括gpx、gstpi、sod1和sod2，同时降低氧化应激调控通路中对抗毒性损伤的红氧敏感转录因子nrf-2的表达。COL茎提取物预处理逆转了这些基因下调。既往研究强调Nrf-2的保护作用，其过表达可降低顺铂诱导的细胞死亡易感性。Jia等的研究表明Nrf-2信号缺失消除了芹菜素的耳保护效果，凸显了Nrf-2驱动的谷氨酸半胱氨酸连接酶复合物/GSH和SOD2抗氧化通路在减轻氧化应激触发毛细胞死亡中的基本作用。Zhang等报道洋蓟素通过Nrf2依赖性NLRP3炎症小体抑制改善脊髓损伤。
耳毒素暴露导致斑马鱼侧线神经丘耗竭，这与游泳行为受损相关，已被用作反映斑马鱼侧线系统功能完整性的表型结局。研究提出游泳性能的恢复代表毛细胞保护的生物标志物，为耳保护剂的快速筛选提供有前景的平台。结果显示，顺铂处理显著诱导运动功能障碍，而COL茎有效改善了凋亡性毛细胞损伤导致的功能缺陷。
综上所述，本研究首次表明COL茎是一种新型耳保护剂，表征了其对顺铂诱导毛细胞损伤的保护作用，并进一步使用转基因斑马鱼筛选平台提供了潜在调控通路的见解。研究结果证明COL茎具有耳保护功效，通过ROS清除和nrf-2介导的红氧稳态调节，在顺铂损伤下保护侧线毛细胞存活率和MET功能，从而减轻氧化-炎症应激和凋亡。斑马鱼行为表型分析揭示运动改变与毛细胞完整性之间的直接关联，支持其作为高通量筛选系统的应用。COL茎通过保护MET功能和红氧稳态，防止氧化应激诱导的凋亡和行为损伤，从而保护斑马鱼侧线毛细胞免受顺铂诱导损伤。
