Ungernia victoris与U. sewerzowii天然植物、体外再生植株及愈伤组织培养物的抗氧化潜力比较评价

《Antioxidants》：Comparative Evaluation of Antioxidant Potential in Natural Plants, In Vitro Regenerants, and Callus Cultures of Ungernia victoris and U. sewerzowii

　　

Ungernia victoris与U. sewerzowii（石蒜科（Amaryllidaceae J.St.-Hil.））是中亚地区稀有的药用植物物种，以其作为生物活性石蒜科生物碱的生产来源而闻名，包括加兰他敏（galantamine）。在该项研究中，研究人员对不同种类植物材料的抗氧化活性进行了比较评价，包括自然种群植株、植物园栽培植株、体外再生植株、愈伤组织培养物、体外获得的鳞茎以及种子。基于直接器官发生（direct organogenesis）和间接器官发生（indirect organogenesis），研究人员采用Murashige and Skoog（MS）培养基和Vollosovich et al.（Vch）培养基，结合多种植物生长调节剂组合，建立了微繁殖体系。抗氧化活性采用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）和ABTS（2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）自由基清除法测定，结果以IC₅₀值（半数抑制浓度）表示。研究发现，抗氧化活性随种群来源、生物材料类型以及体外培养条件的不同而存在显著差异。在自然种群中，U. sewerzowii的抗氧化活性高于U. victoris。愈伤组织培养物表现出最高的抗氧化活性，而体外衍生鳞茎的活性相对较低。DPPH法与ABTS法测定结果之间存在显著正相关性，证实了结果的可靠性，并表明多种类型次生代谢产物共同贡献了抗氧化活性。这些发现凸显了Ungernia愈伤组织培养物作为生产抗氧化活性化合物的生物技术平台的潜力，并为可持续利用策略提供了支持。

近年来，天然抗氧化化合物的来源日益受到关注，因其在预防和治疗与氧化应激相关疾病中发挥重要作用。活性氧（reactive oxygen species, ROS）包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢，是细胞代谢的天然副产物，但其过量积累可导致脂质、蛋白质和核酸损伤。氧化应激与衰老相关疾病、癌症、心血管疾病、炎症性疾病以及帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。植物源性天然抗氧化剂因其高生物活性和相对较低的毒性而备受关注，而石蒜科（Amaryllidaceae）植物更是其中最具潜力的生物活性化合物来源之一。该科已鉴定出超过600种生物碱，其中加兰他敏（galantamine）作为乙酰胆碱酯酶抑制剂广泛用于阿尔茨海默病的药物治疗。

Ungernia属是石蒜科中一个重要类群，主要分布于中亚地区，多种植物为山地特有种，具有显著的药理潜力。U. victoris叶片和鳞茎中总生物碱含量约为0.5%~0.52%，加兰他敏在干叶总生物碱混合物中约占0.13%~0.15%，此外还含有石蒜碱（lycorine）、霍多碱（hordenine）、他泽汀（tazettine）、帕克拉替宁（pancratinine）和dl-那维定（dl-narwedine）等约十种生物碱。U. sewerzowii叶片中则以石蒜碱为主要成分，还含有帕克拉替宁、加兰他敏、dl-那维嗪（dl-narvezine）、希佩阿斯特林（hippeastrine）、昂格雷明（ungeremine）、他泽汀、昂格林（ungerine）和昂塞维（unsevine）等生物碱。尽管这些物种具有重要的药理价值，但关于其抗氧化活性的数据仍然有限，且不同植物材料的抗氧化潜力尚未得到充分研究。

随着自然资源的日益减少，植物细胞和组织培养被认为是替代传统野生植物原料采集的有前景的途径，尤其对于那些因过度采集、人为影响和环境变化而导致种群数量下降甚至面临灭绝的珍稀濒危物种而言，体外培养方法不仅是获取有价值次生代谢产物的有效手段，也是保护珍稀和特有植物物种遗传资源的重要工具。基于此背景，本研究旨在对U. victoris和U. sewerzowii两种Ungernia属植物的多种植物材料进行抗氧化活性的比较分析，以确定最有前景的抗氧化化合物来源，拓展对Ungernia属物种生化潜力的认识。该论文发表于《Antioxidants》期刊。

研究人员为开展此项研究所采用的主要关键技术方法包括：第一，植物材料采集与微繁殖体系建立，自然种群植物材料采自乌兹别克斯坦山区（U. victoris来自苏尔汉河州希萨尔山脉的帕米尔-阿莱山系，U. sewerzowii来自塔什干州西天山），并建立了基于直接器官发生和间接器官发生的微繁殖体系；第二，高效液相色谱（HPLC）分析，采用配备ZORBAX Eclipse Plus C₁₈反相柱的Agilent 1260 Infinity系统进行色谱分离，用于检测加兰他敏等生物碱成分；第三，DPPH自由基清除法测定抗氧化活性，通过Cary 60紫外-可见分光光度计在517 nm处测定吸光度；第四，ABTS自由基阳离子脱色法测定抗氧化活性，同样在Cary 60紫外-可见分光光度计上于734 nm处检测；第五，统计分析采用Microsoft Excel 2019 Analysis ToolPak进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和Pearson相关性分析。

研究结果部分，研究人员从以下几个维度进行了系统阐述。

第一，U. victoris和U. sewerzowii的微繁殖研究。两种物种均表现出直接器官发生和间接器官发生途径，形态发生响应随植物生长调节剂组合而异。在间接器官发生中，以萌发种子的下胚轴作为外植体，在V5（2,4-D 0.5 mg/L + BAP 0.5 mg/L）、V56（2,4-D 0.5 mg/L + Kin 0.5 mg/L）等培养基上诱导愈伤组织，随后转移至再生培养基V17、V32、V44、V68等，通过调节生长素与细胞分裂素比例促进小鳞茎形成，六个月内每外植体可产生100~150个小鳞茎。直接器官发生则不经过愈伤组织阶段，直接在V17、V32、V44、V68等培养基上形成2~3个小鳞茎。从外植体引入到适应土壤条件的周期为5~6个月。

第二，U. victoris抗氧化活性的种内变异。自然种群中UV2（Nilu）的DPPH活性最高（IC₅₀ = 1368.0 ± 51.3 μg/mL），而UV1（Polgasay）最低（2397.8 ± 85.6 μg/mL）；ABTS法中UV4（Sovukbulok）活性最高（471.2 ± 19.4 μg/mL）。植物园栽培样品UV3_BG（Poyaz）表现出最低的DPPH IC₅₀值（685.7 ± 26.1 μg/mL），甚至优于多数自然种群。愈伤组织培养物活性极高，尤其是UV1_V56（DPPH: 782.6 ± 28.4 μg/mL; ABTS: 1.84 ± 0.07 μg/mL）和UV1_V5（DPPH: 825.6 ± 29.7 μg/mL; ABTS: 4.91 ± 0.20 μg/mL），但UV1_V16活性明显较弱。体外衍生鳞茎活性显著较低，如UV2_B的DPPH IC₅₀达8989.0 ± 321.4 μg/mL。

第三，U. sewerzowii抗氧化活性的种内变异。该物种整体抗氧化活性高于U. victoris。自然种群中US4（Beldersay）DPPH活性最佳（433.10 ± 16.1 μg/mL），US3_1（Aksarsay）ABTS活性最佳（300.52 ± 11.4 μg/mL）。植物园样品US3_BG表现突出（DPPH: 428.80 ± 15.7 μg/mL; ABTS: 297.02 ± 11.2 μg/mL）。愈伤组织培养物中US3_VK活性极高（DPPH: 857.65 ± 31.7 μg/mL; ABTS: 0.42 ± 0.02 μg/mL），但添加TDZ或增强生长素组分后活性急剧下降。

第四，培养基和植物生长调节剂对抗氧化活性的影响。研究发现培养基组成和植物激素调控是决定愈伤组织培养物抗氧化活性的关键因素。U. victoris中Vch培养基搭配Kin的V56和搭配BAP的V5效果最佳；U. sewerzowii中VK和V56培养基效果最佳。研究表明，针对生物量生产和抗氧化化合物积累需要分别进行双重优化。

第五，DPPH与ABTS法测定结果的相关性分析。两种方法测定值之间存在显著正相关性，表明抗氧化化合物能够有效与DPPH自由基和ABTS自由基阳离子均发生反应，结果可靠。高相关性提示抗氧化活性并非归因于单一化合物，而是多种次生代谢产物的复合贡献，包括石蒜科生物碱（如加兰他敏）、酚类化合物、黄酮类等。HPLC分析确认了加兰他敏的存在（保留时间约2.3~2.4 min），为石蒜科生物碱的积累提供了证据。

第六，研究结果对药物生产和物种保护的意义。研究明确了最有前景的抗氧化活性材料来源：对于U. victoris，包括UV2、UV4自然种群、UV3_BG植物园样品以及UV1_V56、UV1_V5愈伤组织系；对于U. sewerzowii，包括US3、US4自然种群、US3_BG植物园样品以及US3_VK、US3_V56愈伤组织系。研究结果证实，保护这些物种不仅涉及自然种群保护，还应包括建立迁地保护和体外培养系统，以减轻对自然群落的压力，同时保留获取宝贵代谢资源的途径。

研究结论部分指出，U. victoris和U. sewerzowii的抗氧化活性受三个层次因素的综合影响：种群来源、生物材料类型以及体外培养条件下的培养基组成和植物激素调控。种内化学多样性、对培养条件的依赖性以及定向增强次生代谢产物生物合成的可能性，使这两种研究物种成为药物生物技术和保护项目的有前景对象。尽管所研究样品的抗氧化活性低于参考抗氧化剂抗坏血酸，但在自然种群、体外衍生材料和愈伤组织培养物之间观察到显著差异。对于U. victoris，最有前景的抗氧化平台是来源于UV1在V56和V5培养基上的愈伤组织系；对于U. sewerzowii，自然种群中US3和US4表现出最高的天然抗氧化活性，而愈伤组织培养物中最有前景的是来源于US3在VK和V56培养基上的系。这些发现表明，选定的愈伤组织培养物可作为抗氧化化合物的可持续来源，并为进一步优化生物技术生产系统提供基础。