《Biosensors》：Nanozyme-Driven Multiplex Signal Lateral Flow Immunoassays for Chemical Contaminants in Food: A Review
食品中的化学污染物对公共健康构成严重威胁，亟需灵敏、快速且可现场筛查的检测方法。侧向层析免疫分析(lateral flow immunoassay, LFIA)虽具备快速便携的优势，但存在单信号读出及标记物稳定性不足的局限。纳米酶作为一类具有类酶催化活性且稳定性优异的纳米材料，为解决上述问题提供了极具潜力的信号标记策略。此外，其多样的理化性质可实现多重信号读出，即在单条检测线上同时产生两种或多种互补信号（如比色、荧光、化学发光、光热及表面增强拉曼散射）。该多重策略通过信号放大与自校准显著提升了检测的灵敏度、准确度与可靠性。本综述系统概述了应用于多重信号LFIA的纳米酶的催化特性及其主要类型，总结了基于纳米酶的多重信号LFIA所采用的信号组合策略，并重点介绍了其在兽药、真菌毒素、农药及其他食品化学污染物检测中的应用。最后，讨论了该领域当前的挑战与未来展望，旨在为设计面向食品安全监测的高性能纳米酶基多重信号LFIA平台提供指导。
1. 引言
食品生产、加工、运输及储存全链条中可能存在痕量化学污染物，包括兽药、真菌毒素、农药、非法食品添加剂及重金属离子等。长期暴露于此类污染物与抗菌素耐药性、致癌性、内分泌干扰、神经发育障碍、急性中毒甚至死亡密切相关，对公共健康构成重大威胁。因此，迫切需要灵敏、准确、快速且可现场实施的筛查手段以保障食品安全监管。传统仪器分析方法如高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱(gas chromatography, GC)及气相色谱-质谱联用(GC-MS)虽具备优异的灵敏度与特异性，但通常依赖昂贵仪器、复杂的样品前处理及专业人员操作，难以满足大规模现场监测需求。免疫分析法尤其是侧向层析免疫分析(LFIA)凭借操作简便、快速及成本低廉等优势成为有力替代方案。然而，传统LFIA的性能受限于两大瓶颈：一是依赖胶体金纳米颗粒(gold nanoparticle, GNP)聚集产生比色信号，其摩尔消光系数低且稳定性有限，导致灵敏度与准确性不足；二是GNP仅能提供单一比色信号用于视觉定性，无法实现痕量食品污染物精准定量所需的定量数据。近年来，整合两种或多种互补输出信号进行定量的多重信号读出策略被引入LFIA系统。这些方法利用比色信号实现快速定性筛查，同时借助荧光、化学发光、光热、电化学或表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)等其他信号实现目标物的准确定量。与单信号读出相比，多重信号读出优势显著：独立的信号通道可实现针对非目标干扰的自校准与自我验证，显著提升灵敏度与准确性；此外，可根据具体场景选择合适的输出信号，提高检测灵活性。实现此类多重信号LFIA的关键在于合理设计能够同时输出多种信号的标记物。纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料，可催化天然酶底物及相关生化反应。与传统标记物不同，纳米酶不仅表现出固有的理化特性（如颜色、荧光、磁性或光热转换能力），还拥有催化活性（如过氧化物酶(peroxidase, POD)样或氧化酶(oxidase, OXD)样活性），可用于放大信号或产生新信号。例如，Fe3O4纳米酶兼具磁性与POD样活性，可同时实现目标富集与信号读出；钙钛矿纳米酶表现出强荧光发射与POD样活性，可实现同步的荧光与催化比色信号；金纳米酶则集成了SERS活性与催化能力，支持双模式检测。这些多功能特性使纳米酶成为开发多重信号LFIA平台的理想选择。鉴于食品化学污染物的严重风险及LFIA作为快速现场筛查工具的关键作用，全面总结与批判性评估纳米酶驱动的多重信号LFIA在该类污染物检测中的进展具有重要意义。现有综述多未聚焦于LFIA或缺乏针对多重信号读出策略及食品化学污染物的系统性梳理。为填补这一空白，本综述首次全面且批判性地概述了近七年来纳米酶基多重信号LFIA在食品化学污染物检测中的进展，首先介绍多重LFIA中纳米酶的催化特性与分类，随后总结该类平台采用的信号组合策略，重点阐述其在兽药、真菌毒素、农药及其他有害物质检测中的应用，最后批判性讨论当前挑战与未来展望，包括提升催化效率、结合机器学习进行数据解析、开发便携式读出装置及实现多分析物同步检测。
2. 多重信号LFIA中纳米酶的催化特性与类型
由于纳米酶固有的类酶催化活性及其支持多种信号输出的特性，其已被广泛用作多重信号LFIA平台的功能标记物。理解其催化特性与分类是设计高性能LFIA平台的基础。本节首先介绍主要的类酶催化活性类型，再依据材料组成对多重信号LFIA中常用的纳米酶进行分类。
2.1 纳米酶的类酶催化特性
纳米酶已被发现具有多种催化活性，主要包括POD样、OXD样、过氧化氢酶(catalase, CAT)样及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)样活性。其中POD样活性是最早被发现且研究最为广泛的，其催化过程主要通过活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成或电子转移实现。具体而言，POD样纳米酶催化H2O2生成羟基自由基(•OH)等ROS，进而氧化特定底物（如将显色底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)转化为氧化态TMB）。在电子转移过程中，纳米酶充当电子转移介体，促进底物与H2O2之间的电子转移以加速氧化还原反应。通常POD样纳米酶遵循典型的米氏(Michaelis–Menten)动力学，较低的米氏常数(Km)表明其对底物具有更高的亲和力。与POD样活性相比，OXD样纳米酶以O2为电子受体催化底物氧化，同样通过电子转移与活性物种生成途径产生H2O2或H2O。OXD样纳米酶同样遵循米氏动力学，其对TMB的Km值通常低于天然辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)，这归因于其更高的比表面积与更多的活性位点，增强了底物吸附与结合能力。由于无需不稳定的H2O2参与底物氧化，OXD样纳米酶在分析应用中备受关注。CAT样活性催化H2O2转化为H2O和O2，在缓解氧化应激与组织缺氧的疾病治疗中具有重要作用。SOD样纳米酶则能够清除超氧阴离子(•O2?)并将其转化为H2O2和O2，因其在治疗氧化应激相关疾病方面的抗炎与抗氧化潜力而受到重视。
2.2 多重信号侧向层析免疫分析中使用的纳米酶类型
凭借独特的类酶催化活性、高稳定性、优异的结构可调性及成本效益，纳米酶已成为LFIA中传统GNP标记物的理想替代品。除催化功能外，纳米酶还可能具备超顺磁性、可见区光吸收、荧光、光热转换及SERS活性等多功能特性，非常适用于开发双模式或多模式LFIA。根据材料组成，多重信号LFIA中使用的纳米酶可分为金属纳米酶、金属氧化物纳米酶、碳纳米酶、金属有机框架(metal organic framework, MOF)纳米酶及复合纳米酶。
2.2.1 金属与金属氧化物纳米酶
金属纳米酶含有至少一个作为催化活性中心的金属元素，根据金属元素的差异可进一步分为单金属与金属合金。由于催化活性与稳定性优异，金属基纳米酶被广泛应用于LFIA。过渡金属（如铁、钴、锰、铜基）纳米酶之外，贵金属（金、银、铂、钯、钌、铑、铱）基纳米酶因其独特的电子构型促进快速电子转移并降低活化能垒，表现出更优的催化效率。金属氧化物纳米酶也是化学污染物检测LFIA中常用的标记物，相较于金属纳米酶更易合成且成本更低。作为首个报道的POD样纳米酶，Fe3O4纳米酶兼具免疫磁捕获富集能力与POD样活性，可用于黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)检测，通过磁分离实现目标富集，并利用其固有比色信号与催化TMB产生的增强比色信号进行检测。除POD样金属氧化物纳米酶外，OXD样金属氧化物纳米酶也被用于LFIA开发。然而，金属与金属氧化物纳米酶极高的表面自由能易导致严重团聚与分散稳定性差，限制了其在LFIA中的实际应用。
2.2.2 碳纳米酶
碳纳米酶是一类由非金属元素组成的具有类酶活性的碳基纳米材料，主要包括石墨烯、氧化石墨烯(graphene oxides, GOs)、碳点(carbon dots, CDs)、石墨烯量子点、碳纳米管及富勒烯。与其他纳米酶相比，碳纳米酶成本较低但催化活性相对较弱，因此常与其他材料复合以提升LFIA性能。例如，通过在GO纳米片上组装金与金铂纳米颗粒构建GO/Au-AuPt纳米酶，其中GO提供大比表面积与稳定性，金纳米颗粒增强比色能力，金铂组分产生优异的POD样活性，成功开发了可同时检测庆大霉素(gentamicin, GM)、克仑特罗(clenbuterol, CLE)及莱克多巴胺(ractopamine, RAC)残留的比色/催化增强比色双信号输出LFIA。
2.2.3 MOF纳米酶
MOF纳米酶是由金属离子与有机配体配位形成的多孔晶体材料，其高孔隙率、大比表面积及可调的活性位点使其在气体吸附、储能与分析领域应用广泛。普鲁士蓝MOF纳米酶因其固有比色特性、高POD样活性及优异的生物相容性，被用于构建双读数LFIA以实现RAC与CLE的同时检测，通过催化TMB氧化实现比色信号放大，显著提升了精度并拓宽了检测范围。然而，MOF纳米酶仍面临形貌与粒径精确控制困难以及在复杂食品基质中抗干扰能力有限的挑战，阻碍了其实际应用。
2.2.4 复合纳米酶
为满足多重信号LFIA开发的多样化需求，将不同纳米酶整合为复合材料成为一种实用策略，可协同增强催化活性并丰富功能特性，克服单一纳米酶在灵敏度与检测模式上的局限。例如，以二维Ni(OH)2纳米片为载体分散铂纳米颗粒设计的Pt-Ni(OH)2复合纳米酶，利用Ni(OH)2的大比表面积与丰富的催化活性位点，以及二者间的强相互作用与协同效应优化底物吸附结合能，实现了催化性能的提升，基于此建立了智能手机辅助的比色/催化增强比色LFIA用于乙草胺与甲氰菊酯残留的现场高灵敏检测。然而，当前复合纳米酶通常通过多步合成组装，制备工艺复杂且结构稳定性受损，如何有效整合不同类型纳米酶以协同增强整体催化活性仍是重大挑战。
3. 纳米酶驱动多重信号LFIA的信号组合策略
传统LFIA依赖GNP免疫探针在检测线(test line, T线)的聚集产生单比色信号，存在灵敏度差与准确性不足的缺陷。相比之下，基于纳米酶的多重信号LFIA可在单条T线上同时产生两种或多种独立互补的信号（如比色、荧光、光热或SERS），这种多信号读出方式通过信号互增强与自校准，大幅提升了LFIA的灵敏度与可靠性。具体的信号组合主要包括比色/催化增强比色、比色/荧光/催化增强比色、比色/化学发光、比色/催化增强比色/光热以及比色/催化增强比色/SERS。
3.1 比色/催化增强比色策略
这是纳米酶基多重信号LFIA中最直接的策略。在该系统中，具有固有颜色的纳米酶衍生免疫探针通过在T线聚集提供即时定性读数。此外，这些免疫探针的催化活性可在层析迁移后催化TMB、3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)等显色底物，产生另一种更强的比色信号。这种额外的催化生成信号显著放大了原始的聚集比色信号，与传统GNP基LFIA相比，实现了灵敏度与线性范围的提升，是一种简单、经济且可靠的强化传统LFIA性能的方法。
3.2 比色/荧光/催化增强比色策略
荧光信号因信噪比更高而表现出优于比色信号的灵敏度。在该LFIA系统中，荧光团（如量子点或荧光微球）通常被固定在T线上，纳米酶标记的聚集通过内滤效应或荧光共振能量转移淬灭荧光产生荧光信号。与上述信号组合类似，纳米酶标记的固有颜色可用于可视化比色信号；其独特的可见区光吸收可淬灭荧光团的荧光以实现荧光信号读出；其催化显色底物的能力则提供额外的比色信号。
3.3 比色/化学发光策略
除催化显色底物外，纳米酶还可催化鲁米诺-H2O2等化学发光底物产生化学发光信号。得益于自发光特性，化学发光信号消除了外部光源干扰，具有更高的灵敏度。在纳米酶基比色/化学发光LFIA中，积累的纳米酶标记的固有颜色提供比色信号，而其催化活性可快速氧化T线上的化学发光底物，产生灵敏的化学发光信号用于准确定量。这两种信号均可轻松通过智能手机记录，便于现场检测应用。
3.4 比色/催化增强比色/光热策略
在比色/催化增强比色/光热多重读出LFIA中，纳米酶标记同时发挥三种功能：其本征颜色产生聚集比色信号，其催化活性催化显色底物产生额外的比色信号，其光热转换能力可利用便携式近红外(n ear-infrared, NIR)激光器产生光热信号。光热模式不受样品基质颜色干扰，具有更高的灵敏度。此外，源自同一标记的三个独立信号提供了多重交叉验证：本征比色信号支持快速目视检查，催化增强信号提升灵敏度并拓宽线性范围，光热模式则实现精确定量。
3.5 比色/催化增强比色/SERS策略
该策略利用纳米酶标记的SERS活性，结合其基本的颜色与催化特性实现LFIA的多重信号读出。具体而言，纳米酶标记的固有颜色介导比色信号，其催化显色底物触发增强的比色信号。对于SERS信号，具有本征局域表面等离子体活性的贵金属纳米酶经拉曼报告分子（如染料分子与硫醇化芳香分子）修饰后，可从积累的免疫探针中产生SERS信号。与其他光学信号相比，SERS信号消除了生物基质的背景干扰，为精确定量提供了极高的灵敏度。这种三模式方法融合了各信号的放大灵敏度与快速性优势，显著提升了传统LFIA的性能。
4. 纳米酶基多重信号LFIA在食品化学污染物中的应用
食品中化学污染物残留的存在对消费者健康构成严重威胁，并严重破坏食品供应链的安全。因此，迫切需要灵敏准确的LFIA用于此类污染物的现场检测，以保障食品安全与公共健康。目前，纳米酶基多重信号LFIA已广泛应用于食品化学污染物的检测，包括兽药、真菌毒素、农药及其他污染物。
4.1 兽药
兽药是用于临床诊断、预防与治疗动物疾病以及改善动物生产性能的一类物质，主要包括抗生素、抗寄生虫药及生长促进剂。当这些物质被非法使用或滥用时，其残留会在动物源性食品中积累，对消费者构成直接风险。目前，纳米酶基多重信号LFIA为兽药残留筛查提供了有力支撑。例如，超小Cu-Au双金属纳米酶作为标记物用于CLE检测的双信号LFIA，其催化TMB-H2O2产生催化放大比色信号，与预催化聚集比色信号结合实现双模式测定，催化放大模式的检出限(limit of detection, LOD)达0.03 ng/mL，较传统GNP基LFIA与预催化比色模式分别降低6倍与2倍。三金属dPdPt-Ir纳米酶凭借增强的POD样活性，催化AEC-H2O2底物体系产生深棕色比色信号，其双信号LFIA对CLE的LOD在催化放大后达7.15 pg/mL，灵敏度较传统GNP基LFIA提升47.7倍。Ti3C2Tx@Pt复合纳米酶作为标记物的双比色LFIA用于氯霉素(chloramphenicol, CAP)检测，初始比色模式在牛奶、鸡肉与鱼肉中的LOD为0.01 μg/kg，AEC放大比色模式的线性范围拓宽至0.0125–1.0 μg/kg，灵敏度较已报道的GNP基LFIA提升50倍。此外，钴单原子纳米酶(CoSAN)可同时催化TMB-H2O2与鲁米诺-H2O2体系，实现双催化比色与化学发光信号输出，基于此开发的比色/催化增强比色/化学发光三模式LFIA用于四环素(tetracycline, TC)检测，三种模式的LOD分别为0.091 ng/mL、0.062 ng/mL与0.056 ng/mL，较GNP基LFIA灵敏度提升43–70倍。钌-聚多巴胺(Ru-PDA)杂化纳米酶集高摩尔消光系数、宽可见区吸收、增强POD样活性与强光热转换能力于一体，基于此开发的比色/荧光/催化增强比色/光热多重LFIA用于赛拉嗪检测，四种模式的LOD分别为0.032 ng/mL、0.0041 ng/mL、0.014 ng/mL与0.0087 ng/mL，灵敏度较传统GNP基LFIA最高提升11.7倍。
4.2 真菌毒素
真菌毒素是由曲霉、镰刀菌、链格孢菌、轮枝菌及青霉菌等真菌产生的小分子次级有毒代谢产物，可在食品链各阶段造成污染，对人类与牲畜健康构成严重威胁。因此，开发快速可靠的多重信号LFIA用于真菌毒素检测是食品安全控制的迫切需求。新型CuS@Au-Pt(CAP)仿生纳米酶具有颜色亮度提升、优异POD样活性与电子传输效率改善三大协同优势，作为LFIA标记物提供直接聚集颜色信号与TMB催化放大颜色信号双读数，用于呕吐毒素(bongkrekic acid, BA)检测，两种模式的LOD分别为0.66 ng/mL与1.05 ng/mL，较GNPs-LFIA提升2.05–3.25倍。球形羧基化磁铁矿纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)兼具磁富集能力与POD样活性，基于此建立的三重比色模式LFIA用于AFB1检测，整合了比色、催化及磁富集加催化放大比色信号读出，三种模式的LOD分别为0.34 μg/L、0.17 μg/L与0.023 μg/L，较初始比色模式灵敏度经催化后提升2倍，经磁富集加催化后进一步提升14.8倍。针对真菌毒素频繁共污染的问题，POD样微生物纳米酶(ESi-AuPt)作为标记物的双模式LFIA可同时检测AFB1、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)与伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)，催化比色模式对三种毒素的LOD分别达0.0016 ng/mL、0.0054 ng/mL与0.0061 ng/mL，线性范围较比色模式提升9–250倍。Au-Pt双金属纳米花(AuPt NFs)作为标记物的三模式LFIA用于AFB1分析，结合了优异的光学特性、POD样活性与强光热转换能力，实现比色、催化增强比色与光热信号读出，LOD分别为0.05 ng/mL、0.01 ng/mL与0.04 ng/mL。“一体化”二维CuS@PDA(CPP)纳米片兼具广谱吸收、POD样活性与卓越光热转换能力，基于此开发的比色/荧光猝灭/催化增强比色/光热四重信号LFIA用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)检测，四种模式的LOD分别为0.032 ng/mL、0.5 ng/mL、0.021 ng/mL与0.056 ng/mL，较GNPs基LFIA灵敏度提升1.75–4.7倍，线性范围拓宽一倍以上。
4.3 农药
农药在农业中的广泛使用极大地增加了人类健康与生态安全风险，农产品中即使是痕量农药残留也可通过生态系统循环在人体中积累并引发严重中毒事件。因此，建立可靠灵敏的多模式LFIA用于食品样品中农药残留检测同样迫在眉睫。具有天然比色能力与极高POD样活性（较Pt NFs高23.7倍）的PtPdRu NFs作为双功能标记物，结合智能手机构建了噻虫嗪检测的三重比色传感平台，三种读数的LOD分别为5 ng/mL（目视）、0.13 ng/mL（灰度定量）与0.03 ng/mL（TMB催化定量），催化增强比色模式较预催化模式灵敏度提升4.3倍。核壳Fe3O4-MOF-Pt复合纳米酶兼具磁分离目标富集、POD模拟活性与固有颜色直接目视读出的能力，用于卡巴呋喃(carbofuran, CAR)检测的双信号LFIA，AEC催化增强比色模式的LOD达0.15 ng/mL，磁特性简化了样品前处理，提升了检测效率。三金属PtPdCo介孔纳米酶标记的三重模式LFIA用于啶虫脒(acetamiprid, ACE)检测，提供比色（LOD 1.7 pg/mL）、催化放大比色（LOD 4.9 pg/mL）与荧光（LOD 0.0115 ng/mL）读数，性能优于已报道的GNP基LFIA。Pt/Ti3C2Tx复合纳米酶兼具深色目视读数、优异CAT样活性催化H2O2分解产生压力信号及高光热转换效率产生温度信号的能力，基于此开发的三重模式LFIA用于毒死蜱(chlorpyrifos, CHL)检测，压力与光热模式可通过便携式设备精确定量，LOD分别达0.04 ng/mL与0.09 ng/mL。蒲公英状Au@Pt纳米酶集宽吸收光谱、高POD样活性、双光谱重叠荧光猝灭能力与卓越光热转换能力于一体，结合聚集诱导发光荧光微球作为荧光团，建立的四重信号LFIA可同时提供光学颜色、催化改善颜色、荧光与光热信号读数，用于ACE检测，四种模式的LOD在0.008 ng/mL至0.098 ng/mL之间，光热模式较GNP基LFIA灵敏度提升56.2倍。
4.4 其他污染物
食品添加剂广泛用于改善食品外观、香气、口感或保质期，但允许添加剂的滥用与非法添加剂的使用会导致食品安全事件并威胁消费者健康。因此，开发快速准确的多重LFIA用于相关食品添加剂检测对食品安全监测至关重要。Au@Pt POD样纳米酶作为信号标记的双比色LFIA用于检测草本茶与地表水中的安替比林，催化放大将传统GNPs基LFIA的LOD从草本茶的4.59 ng/mL与地表水的7.22 ng/mL分别降至3.03 ng/mL与2.0 ng/mL。针对水产品中镇静剂的非法使用，AuPt掺杂的六氰合铁酸铜纳米酶(AuPt@Cu-HCF)作为多功能信号报告分子，其固有颜色提供目视读数，近红外吸收实现光热信号，催化活性驱动TMB氧化实现催化比色放大，TMB催化结合近红外照射产生催化增强光热效应，基于此建立的“四位一体”级联LFIA用于地西泮检测，四种模式的LOD分别为0.82 ng/mL（比色）、12.82 pg/mL（光热）、12.26 pg/mL（催化比色）与4.43 pg/mL（催化光热），可在20分钟内完成检测。核壳结构Au@PB纳米颗粒中，金纳米核赋予显著的比色与SERS响应，普鲁士蓝壳提供优异的POD样活性与近红外吸收特性，基于此建立的比色/催化增强比色/光热/SERS四重模式LFIA用于组胺(histamine, HIG)检测，四种模式的LOD分别为1.07 ng/mL、0.68 ng/mL、0.71 ng/mL与0.01 ng/mL，多信号交叉验证提升了准确性。重金属污染对食品与环境安全构成严重威胁，Au/Ir双金属修饰SiO2(Si@Au/Ir)纳米酶标记的双比色LFIA用于Cd2+检测，催化放大模式的LOD达0.65 pg/mL，动态检测范围宽达0.0015–100 ng/mL。GO-Pt30-AuIr纳米酶用于Cd2+检测的双信号LFIA，催化放大模式LOD达7.02 pg/mL，较传统LFIA灵敏度提升7.12倍，在玉米、生菜、湖水与河水样品中回收率良好。
5. 结论与未来展望
食品样品中的化学污染物对全球食品供应中的公共健康构成了大规模且日益加剧的威胁。因此，建立灵敏、准确且经济高效的现场分析方法对于保障消费者食品安全至关重要。目前，LFIA是用于食品化学污染物现场监测的最常用技术之一。然而，传统的GNP基单信号LFIA存在灵敏度差、稳定性与准确性不足的固有局限。纳米酶与多重信号读出策略的协同结合，在食品化学污染物的灵敏度、稳定性、准确性与精确定量方面实现了实质性提升。本综述系统涵盖了纳米酶基多重信号LFIA在食品化学污染物检测中的最新进展，首先总结了纳米酶的独特催化特性与分类，详细阐述了基于纳米酶多功能特性的新兴信号组合策略，并重点介绍了纳米酶基多重信号LFIA在食品化学污染物检测中的具体应用。
尽管纳米酶基多重信号LFIA在食品化学污染物检测领域极具吸引力且研究兴趣快速增长，但该领域仍面临若干阻碍其实际应用的重大挑战。第一，当前研究主要集中于POD样纳米酶，而OXD样纳米酶可直接催化底物氧化，无需引入不稳定的H2O2，可简化检测流程并提升现场操作的便利性，但该类纳米酶的研究仍处于起步阶段，可选种类相对有限。此外，无论是POD样还是OXD样纳米酶，其整体催化活性仍普遍低于天然酶，限制了LFIA系统的性能进一步提升。因此，合理设计具有高催化效率的纳米酶是实现更优催化增强型多重信号LFIA的关键。单原子纳米酶因其原子级分散的活性位点最大化原子利用率并允许精细调控配位环境以提升催化活性，是一个合适且极具前景的候选者。此外，基于计算机的理论设计策略（如机器学习）可提供原子级的结构-功能关系分析，指导并加速高催化活性纳米酶的发现。第二，纳米酶基多重信号LFIA中多通道多样数据的同步输出使得定量解析复杂化并降低了检测效率。幸运的是，机器学习技术的出现与发展为解析这些输出信号提供了重要工具。通过在大量现有检测数据上训练，机器学习可准确提取关键的定量特征信息，同时消除T线的背景干扰。此外，机器学习可通过融合多信号通道数据加速自校准定量过程，显著提升基于不同信号对的LFIA的准确性。多项研究已验证了机器学习在食品化学污染物的比色/SERS与比色/荧光多重信号LFIA中的实用性，在灵敏度、准确性与检测效率方面均取得了显著提升。第三，LFIA系统中多重信号的整合对读出装置提出了更高要求，尤其是在小型化与便携性方面，这对现场检测至关重要。虽然此类多重LFIA系统尚未见报道，但基于商用便携式装置（如血糖仪）的多模式免疫分析代表了一种有前景的解决方案。此外，配备强大处理单元的智能手机正成为定量分析的交互界面，通过搭载各种微型模块化传感器（如光学、热学与电位传感器），可将多种检测模式集成到单一读出装置中，这也是多重信号LFIA的另一潜在解决方案。第四，多重信号LFIA在复杂食品基质中的实际应用主要受基质干扰与纳米酶催化不稳定性的阻碍。脂肪、蛋白质与多糖等成分可能导致非特异性吸附或干扰信号生成，损害灵敏度与准确性。因此，开发新型样品前处理技术（如微型固相萃取）对于减轻基质干扰至关重要。此外，不同检测环境中pH值与离子强度的变化会影响纳米酶的催化稳定性，导致定量不准确。因此，表面改性与结构封装等策略是增强纳米酶作为LFIA信号标记物在复杂体系中催化稳定性的可行途径。
