《Cells》：Angiogenic Gene Therapy for Lower Extremity Ischemia: Experimental Advances and Clinical Experience
下肢缺血性疾病及慢性肢体威胁性缺血（CLTI）在外科或腔内血运重建治疗不可行的患者中仍构成重大临床挑战。上述局限性推动了利用基因治疗手段促进治疗性血管生成的广泛研究。本综述总结了采用非病毒及病毒基因递送系统转导血管生成因子（包括VEGF、FGF-2、HGF、HIF-1α及SDF-1）的实验与临床研究。文中特别关注载体平台、研究设计、受试人群、临床终点，以及临床前研究与临床试验中报告的安全性结局。尽管多项研究证实了生物学活性及良好的安全性特征，但RAVE和TAMARIS等随机试验未能证明持续且显著的临床疗效。这些发现强调了与治疗性血管生成相关的转化挑战，并揭示了 promising 临床前数据与人体临床结果之间持续存在的差距。该领域的未来进展可能取决于优化的载体工程、组织特异性及可调控基因表达系统、优化的递送策略，以及基因治疗与新兴再生技术的整合。
1. 引言
外周动脉疾病（PAD）是全球最为普遍的血管性疾病之一，约影响2.3亿人，其中约11%表现为慢性肢体威胁性缺血（CLTI）。50岁以下人群该病较为罕见，但在老年人群中发病率可达20%，且无明显性别差异。近年来，中低收入国家下肢PAD患者数量增加了28.7%，高收入国家增加了13.1%。其最重要的危险因素包括高脂血症、高血压、糖尿病、慢性肾病和吸烟；三种及以上危险因素共存可使发病风险增加十倍。人口老龄化以及吸烟和糖尿病对心血管健康的不利影响，将共同推动下肢缺血的人群患病率及经济负担持续上升。
下肢PAD的治疗涵盖生活方式调整、戒烟、物理治疗，以及包括他汀类、抗血小板药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（ARB）在内的二级预防药物治疗。对于生活方式受限的间歇性跛行或出现营养性组织改变的患者，应考虑外科血运重建；CLTI患者则需立即转诊至血管外科。尽管外科和腔内治疗手段取得了显著进步，但血运重建效果仍高度多变，取决于临床、解剖、病理生理及组织因素之间复杂的相互作用。宏观血流的恢复本身并不能保证保肢，临床预后不仅取决于重建血管的通畅性，还取决于微循环的功能状态、组织的再生能力以及全身炎症反应的程度。
最有利的血运重建结果见于疾病早期阶段的患者，此时缺血尚未并发广泛坏死改变或感染性后遗症。保留的微循环和良好的侧支网络有助于干预后有效的血流再分配，从而促进缺血症状消退和营养性缺损愈合。血管床解剖同样重要：远端胫动脉或足动脉通畅、闭塞性病变纵向范围有限，均可显著提高血运重建的技术可行性和长期耐久性。另一有利因素是组织保留的血管生成和神经营养潜能，这支持毛细血管网络恢复、神经支配改善和缺血肢体功能恢复。尽管如此，约20%-40%的患者可能因医学或解剖学原因无法接受血运重建。
因此，下肢缺血的治疗预后取决于宏观血运重建所提供的可能性与组织通过微循环适应和再生对恢复灌注作出反应的能力之间的平衡。CLTI患者中持续居高不下的截肢率凸显了传统治疗方法的局限性，强调了开发针对血管生成刺激、微循环改善和神经保护机制支持等辅助策略的必要性。
基因治疗目前被视为一种旨在刺激治疗性血管生成、改善微循环和支持缺血组织内神经血管机制的策略。然而，尽管临床前研究取得了令人鼓舞的结果，基因治疗策略在下肢缺血中的临床疗效仍然参差不齐，且在很大程度上取决于治疗靶点、递送载体和疾病阶段的选择。近年来，研究者日益关注将基因治疗与基于细胞的技术、生物材料及组织工程平台相结合的联合再生方法——这些策略不仅旨在增强血管生成反应，还确保微循环和神经血管相互作用的更持久恢复。本综述系统整合了来自实验模型和临床研究的最前证据，考察了下肢缺血中先进的基于基因治疗的再生策略，并讨论了主要转化障碍、临床实施前景及未来研究方向。
2. CLTI中治疗性血管生成的血栓炎症和代谢障碍
CLTI中的治疗性血管生成发生在高度复杂的病理微环境中，其特征不仅包括严重的组织低灌注，还包括慢性内皮功能障碍、持续性炎症、氧化应激、代谢失调、血小板激活和持续的促血栓状态。这些相互关联的机制深刻影响内源性血管生成反应，并可能显著降低外源性血管生成因子或基因治疗方法的疗效。在进展期外周动脉疾病中，长期缺血导致进行性内皮损伤，伴随一氧化氮（NO）生物利用度降低、内皮依赖性血管舒张减弱、血管僵硬度增加和机械转导信号改变。功能障碍的内皮细胞对血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和缺氧诱导信号通路的反应性降低，从而限制了适应性的新生血管形成。
慢性炎症是CLTI中血管功能障碍的另一关键决定因素。动脉粥样硬化斑块和缺血组织被释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、干扰素-γ和基质金属蛋白酶（MMPs）的激活巨噬细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞浸润。尽管短暂的炎症信号可通过细胞因子介导的内皮激活最初促进血管生成，但持续性炎症最终可导致细胞外基质降解、内皮细胞凋亡、毛细血管稀疏和血管成熟障碍。过度的蛋白水解活性还可能降解内源性和外源性生长因子，限制其在缺血组织中的生物学可利用性。
CLTI的血栓炎症成分进一步使治疗性血管再生复杂化。血小板激活和凝血酶生成在进展期外周动脉疾病中显著增强，尤其在糖尿病患者中。激活的血小板释放VEGF、血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）和炎症介质，这些可能短暂支持血管生成；然而，慢性血小板激活也促进白细胞募集、内皮功能障碍、氧化应激和微血管血栓形成。凝血酶通过蛋白酶激活受体（PARs）的信号传导促进内皮激活和血管重塑，但同时可能加剧组织损伤和损害微循环灌注。此外，远端微血管内的纤维蛋白沉积和微血栓形成可构成成功诱导毛细血管出芽后有效组织再灌注的结构性障碍。
重要的是，新血管形成的发生并不一定等同于功能性组织灌注的恢复。在缺血和炎症条件下生成的新生血管通常结构不成熟、组织紊乱、高通透性，并缺乏足够的周细胞和平滑肌细胞覆盖。不充分的血管稳定化可导致新毛细血管退行和持久侧支循环建立的失败。因此，有效的治疗性血管生成需要协调调控内皮增殖和迁移，以及动脉生成、细胞外基质重塑、壁细胞募集和长期血管成熟。
越来越多的证据表明，CLTI中受损的血管生成反应性反映了整个神经血管和再生微环境的多因素衰竭，而非单一生长因子的孤立性缺乏。骨骼肌变性、外周神经病变、线粒体功能障碍、干细胞耗竭和衰老相关信号共同导致组织再生缺陷和适应性血管重塑障碍。这些观察结果可能在一定程度上解释了血管生成生长因子和基因治疗 promising 的临床前结果与临床试验中相对温和的疗效之间的差距。因此，CLTI的未来治疗策略可能需要整合多模式方法，同时针对血管生成、内皮修复、免疫调节、抗血栓治疗、氧化应激减轻和代谢纠正。
3. 血小板与缺血组织中的治疗性血管生成
血小板正日益被认为是血管再生和组织重塑的主动调节者，而非单纯止血的介导者。除了经典的血栓形成作用外，血小板是血管生成和免疫调节介质的主要储存库，这些介质对缺血组织修复具有关键影响。激活的血小板从α-颗粒中释放多种生长因子和细胞因子，包括VEGF、PDGF、TGF-β、血管生成素-1（ANGPT1）、FGF和表皮生长因子（EGF），所有这些均参与内皮激活、细胞外基质重塑和新血管成熟。血小板来源的VEGF是内皮增殖、迁移和毛细血管出芽的有效刺激物，而PDGF主要促进周细胞募集、新生血管稳定和成纤维细胞激活。TGF-β进一步调节炎症消退、细胞外基质沉积和巨噬细胞向修复表型的极化。重要的是，血小板也可能根据激活背景和局部微环境释放抗血管生成介质，表明血小板信号对血管生成发挥双向调节作用。
在CLTI中，持续性内皮功能障碍、缺氧、炎症和微血管稀疏伴随增强的血小板激活和血小板-白细胞相互作用。血小板促进炎症细胞募集、内皮通透性和缺血微循环的重塑。同时，血小板来源的生长因子可通过支持血管生成和肉芽组织形成部分代偿受损的内源性再生信号。这些机制在治疗性血管生成和利用VEGF表达载体的基因治疗背景下可能特别相关。VEGF过表达可能与血小板激活通路相互作用，因为VEGF本身调节内皮通透性和血小板-内皮相互作用。此外，VEGF和PDGF通路之间的协同信号对于形成稳定和功能性的血管似乎是必不可少的，因为单纯的VEGF诱导内皮出芽缺乏适当的壁细胞募集时可能产生不成熟和高通透性的血管。实验研究表明，联合VEGF/PDGF信号比单独的VEGF刺激更有效地改善血管成熟和组织修复。
另一临床重要考虑是背景抗血小板治疗对治疗性血管生成的影响。由于双联抗血小板或阿司匹林为基础的治疗构成PAD和CLTI患者的标准治疗，血小板激活的调节可能改变局部血小板来源血管生成介质的可获得性。尽管过度血小板激活的抑制可能减少血栓炎症损伤和改善微血管灌注，但同时也可能减弱参与组织修复的再生生长因子的释放。因此，抗血小板治疗对血管生成疗效的总体影响仍不完全清楚，有待未来的转化和临床研究进一步探讨。
4. CLTI中糖尿病相关的治疗性血管生成障碍
糖尿病是促进CLTI进展的最重要因素之一，糖尿病患者构成 considered for 实验性血管生成治疗"无选择"患者的最大亚群。然而，尽管在糖尿病缺血性疾病中进行了广泛的治疗性血管生成研究，临床疗效仍然有限。越来越多的证据表明，糖尿病微环境深刻损害内源性血管修复机制，并显著降低对血管生成基因治疗的反应性。
糖尿病及相关代谢紊乱在CLTI观察到的受损血管生成反应中发挥核心作用。慢性高血糖诱导线粒体功能障碍和活性氧（ROS）过度产生，导致内皮细胞和循环内皮祖细胞（EPCs）的氧化损伤。在糖尿病组织中，晚期糖基化终产物（AGEs）在细胞外基质和血管壁中积聚，激活AGE受体（RAGE）并促进NF-κB介导的炎症信号传导。该过程增强促炎细胞因子、黏附分子和组织因子的表达，从而维持内皮激活和血管炎症。同时，氧化应激使缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）不稳定，导致尽管持续缺血，但VEGF和其他缺氧反应基因的转录激活受损。因此，糖尿病缺血组织常表现严重缺氧和血管生成代偿不足的矛盾共存。
重要的是，糖尿病缺血微环境的特征不仅包括大血管闭塞，还包括严重的微血管功能障碍、慢性炎症、神经病变和组织纤维化。毛细血管基底膜增厚、周细胞功能障碍和骨骼肌再生受损进一步损害组织氧合和血管反应性。因此，单独刺激血管生成可能不足以恢复进展期糖尿病CLTI的组织完整性。这些病理生理异常可能促成第一代血管生成载体在糖尿病患者中疗效有限的原因。非病毒质粒系统在慢性炎症和纤维化的糖尿病组织中常表现出转染效率低下和短暂的基因表达。病毒载体虽可实现较高的转基因表达，但仍受血管生成信号细胞反应性受损和持续性炎症激活的影响。此外，严重的微血管稀疏可能限制载体在缺血组织中的充分分布。
一些专门针对糖尿病人群的临床研究已证明血管生成基因治疗的治疗潜力和局限性。VM202是一种编码肝细胞生长因子（HGF）的质粒，在痛性糖尿病神经病变中显示出 promising 结果，提示潜在的神经血管再生效应。类似地，Bar?等报道了联合VEGF/HGF基因治疗在伴严重肢体缺血的糖尿病患者中的 encouraging 发现。尽管如此，仍需更大规模的随机研究以确立持久的临床疗效，并识别最可能从这类方法中获益的患者亚群。
鉴于糖尿病缺血性疾病的复杂病理生理学，未来的治疗策略可能需要将血管生成刺激与免疫调节、代谢纠正、神经血管修复和组织再生相结合的多模式方法。涉及多顺反子载体、外泌体介导递送、生物材料辅助平台和联合基因-细胞疗法的新兴方法可能有助于克服与糖尿病微环境相关的某些生物学障碍。
5. 下肢缺血基因治疗演进的关键历史里程碑
下肢缺血基因治疗的发展经历了一系列关键的实验和临床里程碑，反映了从概念验证研究向转化和早期临床应用的逐步转变。
现代血管生成概念的奠基始于20世纪70年代。Judah Folkman 1971年的工作发挥了关键作用，他提出肿瘤生长关键依赖于新生血管生成的诱导，并假设存在刺激血管生长的特异性因子。这一概念为寻找血管生长的分子调控因子奠定了基础。最早被鉴定的血管生成分子之一是FGF家族成员。1974年，Denis Gospodarowicz从牛垂体提取物中分离出一种具有广泛增殖活性的促有丝分裂因子，后鉴定为碱性成纤维细胞生长因子（bFGF/FGF-2）。值得注意的是，FGF-1和FGF-2的命名术语是在后续分子克隆研究（如David Abraham等1986年的工作）确立酸性FGF-1和碱性FGF-2的区别后才引入的。FGF的体内血管产生活性早在1979年即由Gospodarowicz等证实。
血管生成分子生物学发展的决定性阶段是VEGF的发现。1986年，Senger等描述了肿瘤细胞分泌的一种血管通透性因子（VPF）。1989年，Napoleone Ferrara等独立从牛垂体滤泡星状细胞中分离出VEGF，证明其为内皮细胞的特异性有丝分裂原并引入VEGF术语（Ferrara首创VEGF术语，VEGF-A的命名则在VEGF-B、-C和-D发现后用于区分家族成员）。相应基因的分子克隆于1989年由包括Leung等和Keck等于内的多个研究组几乎同时完成，证明VEGF和VPF由同一基因编码。同期，Jean Plou?t等独立从AtT20垂体细胞中纯化出类似的内皮有丝分裂原，初步命名为vasculotropin。20世纪90年代初，主要VEGF受体VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的鉴定为后续VEGF信号研究奠定了基础。
1991年，胎盘生长因子（PlGF）这一参与病理性血管生成的VEGF家族成员被发现。随后VEGF-C和VEGF-D的鉴定扩展了对VEGF家族的理解，证明其不仅参与血管生成，还参与淋巴管生成。血管壁成熟和稳定化因子的研究于20世纪90年代同步发展。研究表明PDGF-B在周细胞募集和功能成熟血管形成中发挥关键作用。内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie2（也称TEK）于系统筛选新型受体酪氨酸激酶过程中被鉴定和克隆。与其密切相关的Tie1受体共同定义了一类新的内皮富集受体亚类，参与血管发育。虽然其配体最初未知，但1990年代中期血管生成素（ANGPT）的发现，特别是作为Tie2激动剂的ANGPT1，解决了这一问题。
至此，到20世纪末，一个多层次的血管生成模型已经形成，包括VEGF、通透性和重塑调控因子，以及确保新生血管成熟和功能稳定的分子（PDGF-B、ANGPT1/2）。这些发现为治疗性血管生成策略和缺血性疾病的基因治疗奠定了基础。
从血管生成的基本分子发现（1970-1990年代）到临床应用的转化常被过于 abrupt 地呈现，忽略了关键的中间阶段——动物模型中的临床前验证。实际上，VEGF和FGF等血管生成因子向治疗策略的转化，关键在于可重复的在体缺血模型的发展。一个重要的里程碑是1994年Ryuichi Takeshita等开发的后肢缺血模型，该模型允许对血管生成因子给药后的新生血管形成、灌注恢复和功能预后进行定量评估。随后，该模型及兔和小鼠等相关系统成为测试蛋白质递送和新兴基因治疗方法 indispensable 的平台，证明了概念可行性并确立了剂量-反应关系。Jeffrey M. Isner等随后的研究通过将VEGF基因转移应用于缺血组织，进一步推动了该领域发展，有助于将临床前发现转化为早期临床研究。
下肢缺血基因治疗于1990年代中期在治疗性血管生成的概念框架内出现，早期试点和I期研究，特别是Jeffrey M. Isner等的研究，证明局部递送编码VEGF165的质粒可在CLTI患者中诱导新生血管形成和改善灌注，从而支持该方法的进一步发展。2000年代，随着大规模临床试验的启动，治疗基因谱扩展至FGF、HGF和缺氧诱导因子1α（HIF-1α），并开发了多种递送系统，包括质粒和病毒载体。
多种基因治疗产品已开发用于外周动脉疾病的治疗性血管生成。值得注意的是，Neovasculgen（编码人VEGF165的质粒，2011年注册）和Collategene（编码HGF的质粒，2019年注册）已 undergo 临床评估。
近年来，研究者的注意力转向联合基因治疗策略，包括血管生成和细胞保护因子的同时表达，或多个互补血管生成因子的联合，以及给药剂量和途径的优化。特别是，近年来涉及基因组合给药的研究在下肢缺血患者（包括糖尿病患者）中显示出 promising 结果，凸显了多因素方法治疗下肢缺血的潜力。
6. 关键血管生成和保护性因子
6.1 VEGF
在血管生成介质中，VEGF仍是实验和临床环境中研究最广泛的蛋白质。VEGF构成一个异质性配体家族（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF），与酪氨酸激酶受体VEGFR1（Flt1）、VEGFR2（KDR/Flk1）和VEGFR3（Flt4），以及共同受体神经纤毛蛋白-1/2和膜蛋白聚糖如Syndecan-2相互作用，这些共同受体调节配体亲和力、受体同源和异源二聚化以及信号的组织时相。
VEGF-A通过mRNA选择性剪接产生多种异构体，其长度和细胞外基质（ECM）及共同受体结合能力各异。主要异构体包括VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206，其肝素结合特性不同，从而决定其分布和生物利用度。VEGF165是最丰富和生物学活性最强的异构体，而VEGF121也表现出显著的血管生成活性。VEGF189由于与细胞外基质强结合而功能更为局限。这种异构体多样性为生理和病理条件下的血管生成提供了灵活的组织时相调控。
VEGF-A是血管生成和血管通透性的关键介质。VEGFR2作为VEGF-A的主要信号受体；激活后发生二聚化、激酶结构域反式自磷酸化（关键残基Y1054/Y1059）以及C末端区域多个酪氨酸残基（包括Y1175和Y1214）的磷酸化。这些事件使磷脂酶C-γ（PLCγ）、Ras-MAPK级联接头和血流内皮机械敏感反应组分得以募集。VEGFR2激活启动三条主要信号通路：（1）PI3K-Akt通路促进内皮细胞存活、激活eNOS并刺激一氧化氮产生，导致血管舒张和内皮保护；（2）Ras-Raf-MEK-ERK通路调控细胞增殖、G1/S期转换以及细胞周期蛋白和生长因子表达；（3）PLCγ-PKC-Ca
2+通路诱导PIP
2水解产生IP
3和DAG，升高细胞内Ca
2+水平，激活PKC，并快速重塑细胞间连接。这些信号的时程和定位取决于VEGFR2的胞内运输，包括内体MAPK信号传导。VEGF通过VEGFR2的信号进一步受Notch通路调控，该通路确保适当的血管图案化；而VEGF-Notch平衡的破坏导致血管网络组织紊乱和过度分支。
VEGF-B（异构体B167/B186）主要结合VEGFR1和神经纤毛蛋白-1而不激活VEGFR2，支持心脏内皮细胞存活、促进冠状动脉血管生成、在缺血条件下提供保护，并调节脂肪细胞脂质代谢。与VEGF-A相反，VEGF-B不增加血管通透性，仅微弱参与肿瘤血管生成。VEGF-C和VEGF-D主要激活VEGFR3并介导淋巴管生成，高浓度配体时可能参与VEGFR2，导致联合的血管和淋巴管生成反应。
胎盘生长因子（PlGF）包含四种异构体（PlGF-1至4），主要结合VEGFR1（Flt1）和神经纤毛蛋白-1，不激活VEGFR2。PlGF在非缺血条件下刺激内皮细胞增殖和迁移，参与胎盘血管重塑，并通过与VEGF-A的协同作用经VEGFR1/2异源二聚体促进胚胎器官血管生成。
在生理层面，VEGF对胚胎血管发生至关重要——实验模型中VEGF杂合丢失导致胚胎致死。在成体中，VEGF执行多种功能，包括伤口愈合、缺血时冠状动脉和侧支血管生长、维持内皮稳态以及保留毛细血管周细胞覆盖。除血管效应外，VEGF还发挥广泛的血管外功能。在中枢神经系统中，VEGF-A作为神经保护因子，减少脑卒中模型中的缺血损伤范围并通过血管生成效应（增强灌注）和对神经元及胶质细胞的直接作用改善预后。在神经退行性疾病中，特别是阿尔茨海默病，VEGF水平升高与更好的海马保留、认知功能下降减缓和小胶质细胞淀粉样蛋白-β吞噬增强相关。在免疫系统中，VEGF-A主要通过单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞上的VEGFR1促进其向炎症部位募集，调节黏附分子表达和细胞因子网络，同时参与炎症性血管损伤和水肿以及内皮修复和再生。
值得关注的是，VEGF的产生并非恒定不变，而是根据机体生理需求动态调控。临床研究表明，慢性缺血与骨骼肌中VEGF水平的显著局部升高相关。血运重建前，缺血小腿腓肠肌（m. gastrocnemius）中的VEGF浓度显著高于非缺血对照肌肉（m. vastus lateralis），反映缺氧诱导的血管生成反应的激活。成功恢复血流后，先前缺血肌肉中的VEGF水平显著下降并接近对照组织水平，而非缺血肌肉则无显著变化。这些发现表明，VEGF在肢体缺血中作为局部组织缺氧的敏感标志物，反映了一种适应性的、但尚不足够有效的内源性血管生成刺激尝试，其在缺乏旨在恢复灌注的干预措施时不能阻止缺血进展。
6.2 FGF
FGF是一个大型肝素结合生长因子家族，包含至少20种结构相关蛋白，其中FGF-1和FGF-2是经典的血管生成配体。它们与内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞上表达的酪氨酸激酶受体家族FGFR1-FGFR4相互作用，激活细胞内信号级联（PI3K/Akt、MAPK/ERK、PLCγ），刺激血管壁细胞增殖、迁移和存活，构成新血管形成的基础。
经典FGF并非总是作为血管生成的直接启动子，而是可能调节其他关键因子的表达，最显著的是通过刺激VEGF-A及其受体，这些对血管通透性和新毛细血管生长至关重要。在FGFR1缺陷模型中，FGF信号通路的破坏减少VEGF产生并导致血管网络缺陷，表明FGF作为协调其他血管生成系统在新血管形成过程中的核心作用。FGF-2增强包括HGF和PDGF在内的促血管生成蛋白的表达，还刺激参与细胞外基质重塑的金属蛋白酶分泌，这是内皮细胞迁移和血管管腔形成所必需的。在某些情况下，FGF信号是维持内皮细胞对VEGF刺激反应性和稳定新生血管所必需的。实验数据显示，FGF-1和FGF-2是体外内皮细胞的有效促有丝分裂原，能够刺激毛细血管样结构形成，其表达与组织损伤和肿瘤生长过程中的血管生成活性相关。与作用于高度特化内皮受体的VEGF相比，FGF配体-受体系统在细胞靶向方面更为普遍，影响血管壁和基质的多种细胞类型，使其成为适应性血管可塑性的重要机制。
研究表明，慢性下肢缺血患者的缺血骨骼肌表现出对长期低灌注明显的结构和分子适应特征。特别是，缺血肌肉的毛细血管获得动脉化特征，包括血管壁增厚和平滑肌细胞出现，伴随内皮和血管周围细胞中FGF-2表达的显著增加。FGF-2水平与缺血严重程度和血管重塑程度相关，表明其在慢性缺血病变中诱导结构更成熟稳定血管方面的关键作用。这些发现表明，FGF-2不仅参与毛细血管血管生成，还参与动脉生成和血管稳定化过程，这使其与VEGF介导的血管生成反应有所区别，并凸显了FGF-2作为慢性下肢缺血联合治疗策略组分的潜力。
6.3 HGF
HGF是一种主要由基质细胞分泌的多效性间充质细胞因子，作用于上皮和内皮细胞，通过特异性酪氨酸激酶受体c-Met（MET）发挥作用。HGF调控细胞生长、迁移、形态发生和存活，使其成为胚胎器官发育、成体组织再生和伤口愈合的关键因子。分子水平上，HGF以无活性前体（pro-HGF）形式产生，在组织损伤部位由丝氨酸蛋白酶激活。活性形式随后与靶细胞表面的c-Met结合，诱导受体二聚化并激活酪氨酸激酶信号，促进内皮细胞增殖、迁移和存活（抗凋亡）。
体外研究表明，HGF通过ERK-、STAT3-和AKT依赖性通路诱导内皮细胞生长和形态发生，同时保护这些细胞免受缺氧诱导的凋亡，从而促进血管结构在组织损伤或缺血反应中的形成。HGF作用的分子机制包括通过激活转录因子ETS-1及相关c-Met → PI3K/Akt/ERK信号通路上调关键血管生成基因如VEGF，增强内皮细胞迁移和细胞外基质重塑，两者对新血管形成均必不可少。因此，HGF释入细胞外基质增强新生血管形成过程中的VEGF活性。HGF还通过依赖HIF-1α激活的机制增强多种细胞类型中VEGF-A的产生，进一步放大缺氧条件下的血管生成反应。
临床研究表明，肢体缺血患者与对照相比表现出升高的HGF血清水平，而血运重建后HGF浓度下降，表明其对组织缺氧的激活反应及其在适应性血管重塑过程中的参与。然而，需注意HGF对肌肉再生的 context-dependent 效应，特别是其激活时间失调时。Miller等的研究证明，HGF在骨骼肌再生早期通过激活静止卫星细胞并刺激其增殖发挥关键作用。尽管如此，尽管肌母细胞数量增加，HGF给药并未加速肌肉组织再生。相反，HGF被证明抑制肌母细胞分化和肌管形成，维持细胞于增殖状态。这些发现表明，HGF主要作为卫星细胞的早期激活信号，而后续肌肉细胞分化需要其活性降低。这些特性为涉及不同时程递送编码HGF质粒（包括与VEGF联合）的基因治疗方法提供了理论依据。基于临床研究的观察结果，此类策略在不久的将来可能成为CLTI患者的有效治疗选择。
6.4 SDF-1
基质细胞衍生因子1（SDF-1）是一种由基质细胞（成纤维细胞、间充质基质细胞等）主动分泌的关键趋化因子，在细胞迁移、存活、增殖和分化调控中发挥关键作用，是血管生成和血管发生的重要介质。SDF-1主要通过与内皮细胞、内皮祖细胞（EPCs）、平滑肌细胞和其他细胞类型上的受体CXCR4和CXCR7发挥作用，激活包括PI3K/Akt、MAPK/ERK和NF-κB在内的多种细胞内级联，促进增强的存活、迁移和血管结构形成。
在血管生成背景下，SDF-1/CXCR4信号刺激内皮细胞和内皮祖细胞的增殖和迁移，增强体外毛细血管样结构形成，并增加体内缺血模型中的血管密度。特别是，SDF-1增加Akt和ERK活性，这对细胞存活和生长很重要，而CXCR4阻断显著抑制这些血管生成效应。此外，不同CXCL12异构体（如CXCL12α和CXCL12β）在刺激增殖、预防凋亡和促进血管网络形成方面表现出不同的功效，反映了生理和病理条件下血管生成过程的复杂调控。SDF-1还作为内皮祖细胞和造血干/祖细胞的有效趋化因子，促进其从骨髓动员和募集至需要新血管形成的缺血或损伤部位。这种相互作用在肢体缺血背景下特别重要，因为SDF-1表达的局部上调形成趋化梯度，吸引CXCR4阳性细胞至新血管形成区域。
除对内皮的直接作用外，SDF-1增强包括VEGF在内的其他血管生成因子的合成，并参与与其他血管生成介质的交叉信号相互作用，从而形成促进血管生长和稳定新生血管的调控网络。因此，SDF-1/CXCR4轴被认为是缺血性疾病治疗性血管生成以及组织再生机制和损伤后血管网络重建的有前景靶点。
已确定，在严重肢体缺血患者中，SDF-1/CXCL12-CXCR4轴的激活作为缺血诱导修复反应的重要组成部分发生。研究表明，与非缺血组织相比，严重肢体缺血患者缺血骨骼肌中SDF-1α（CXCL12）的表达显著增加，而CXCR4受体见于微血管内皮细胞和循环内皮祖细胞。缺血条件下SDF-1的诱导由HIF-1α依赖性机制介导，促进CXCR4+祖细胞从骨髓向缺氧区趋化，从而增强血管生成和新血管形成。然而，尽管SDF-1局部表达增加，严重肢体缺血患者该轴的内源性激活不足以恢复充分灌注，这凸显了自发再生机制的有限能力，并证实了在慢性下肢缺血中治疗性调节SDF-1/CXCR4信号的研究兴趣。
6.5 血管生成素（Angiopoietin）
ANGPT构成在血管生成后期阶段主要发挥作用的血管生长因子家族，在血管网络成熟、稳定和重塑中发挥关键作用。研究最多的成员是ANGPT1和ANGPT2，它们是主要表达于内皮细胞上的酪氨酸激酶受体Tie2的配体。由周细胞、平滑肌细胞和基质成分产生的ANGPT1作为Tie2激动剂发挥作用，促进血管稳定、加强内皮细胞间连接、降低血管通透性，并通过激活PI3K/Akt和eNOS信号通路增强内皮存活。
相反，ANGPT2主要由血管内皮细胞自身表达，作为ANGPT1的 context-dependent 拮抗剂或Tie2的部分激动剂，导致血管壁不稳定化。ANGPT2削弱内皮细胞与周细胞和细胞外基质的相互作用，增加血管通透性，从而"激活"血管进行重塑。在VEGF存在时，这促进活跃的血管生成；而在缺乏VEGF时导致血管退行，突显ANGPT2在血管动态中的协调作用。研究还证明，ANGPT2可通过与整合素结合并激活迁移相关通路（如FAK/Rac1），在低Tie2表达的细胞中独立于Tie2直接刺激内皮细胞迁移和出芽，为复杂的血管生成过程增添了额外的调控层次。
在血管生成中，血管生成素与VEGF或FGF不同，不是主要的内皮细胞有丝分裂原，而是作为血管稳定和可塑性的调节者，决定血管是维持、重塑还是退行。骨骼肌缺血伴缺血性溃疡形成的实验模型显示，VEGF依赖性血管生长和ANGPT1介导的稳定化的联合激活导致功能性成熟和稳定的毛细血管网络形成，而单独的VEGF刺激常与不成熟和高通透性血管的发展相关。
从临床和生物学角度看，ANGPT/Tie2系统对血管稳态发挥功能上相反的作用。ANGPT1主要通过激活Tie2信号作为保护和血管稳定因子，促进内皮存活、加强内皮-周细胞相互作用、降低血管通透性并支持新生血管成熟。这些特性使ANGPT1成为缺血性疾病治疗性血管生成中有前景的介质。相反，ANGPT2通常在缺氧、炎症和内皮激活条件下上调，拮抗或破坏ANGPT1/Tie2信号。ANGPT2表达增加与内皮功能障碍、血管通透性增强、炎症细胞募集和病理性血管重塑相关，特别是在肿瘤和慢性炎症性疾病中。因此，升高的ANGPT2水平与肿瘤和血管疾病的预后不良相关，使ANGPT2成为抗血管生成和血管正常化治疗的重要靶点。
在慢性和严重肢体缺血患者中，已证明ANGPT/Tie2系统的失调，特征为缺血骨骼肌和微血管内皮中ANGPT2表达增加而相对ANGPT1不足。这种不平衡与功能性不成熟和不稳定血管的形成相关。这些发现强调了血管生成素在协调血管从不稳定到成熟的转变中的重要作用，并凸显了基于ANGPT1的策略或联合策略增强CLTI中血管生成疗效的治疗潜力。
6.6 血管生成素（Angiogenin）
血管生成素（ANG）是属于核糖核酸酶家族的血管生成蛋白，最初因其在各种生物模型中诱导新血管形成的能力而被鉴定。ANG具有弱核糖核酸酶活性，这已被证明对其生物学功能至关重要，使其与VEGF或FGF等经典生长因子有所区别。ANG活性受细胞内抑制剂调控，最显著的是核糖核酸酶抑制剂（RI），与其结合可抑制ANG功能。ANG在血管生成中的作用机制涉及内皮细胞激活、迁移、增殖和侵袭的刺激，随后形成管状结构。ANG能够转位至内皮细胞核内，增强核糖体RNA转录，从而促进核糖体生物发生、蛋白质合成和细胞生长——这些是其他血管生成因子作用下维持增殖所需的过程。此外，ANG与内皮细胞表面肌动蛋白的相互作用改变细胞骨架组织并促进细胞外基质重塑，从而促进血管生成出芽。除启动新血管形成外，ANG还可增强其他血管生成因子如VEGF和FGF-2的效应，促进功能性成熟血管的形成。
已确定，CLTI患者血浆和缺血肌肉组织中ANG水平升高，反映缺氧对内源性血管生成机制激活的反应。尽管如此，临床研究表明，内源性ANG上调不足以恢复肢体缺血中的充分灌注。这凸显了通过重组蛋白或基因治疗进行血管生成素调控的治疗潜力，作为CLTI患者刺激血管生成的联合策略的一部分。
6.7 HIF-1α
缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是组织缺氧的关键传感器和血管生成的中心调节者。在常氧条件下，HIF-1α经脯氨酰羟化后通过蛋白酶体途径快速降解。然而，在氧可利用性降低时，羟化受抑制，导致蛋白质稳定化、向核转位，并与HIF-1β形成复合物。该复合物与基因启动子中的缺氧反应元件（HREs）结合，激活包括VEGF-A、FGF-2、ANGPT和SDF-1/CXCL12在内的多种血管生成因子的转录，从而促进内皮细胞增殖和迁移、管状结构形成以及EPCs向缺血部位的募集。缺血模型中的实验研究表明，体内HIF-1α稳定化增强功能性毛细血管网络的形成并促进血管重塑，确认其在生理性和治疗性血管生成中的关键作用。因此，HIF-1α作为缺氧反应的中心调节者，整合来自多种血管生成因子的信号，确保缺血组织中血流的协调恢复。
在CLTI患者中，缺血骨骼肌中HIF-1α水平显著升高，伴随其靶基因（包括VEGF、SDF-1/CXCL12、FGF-2和ANGPT）表达的增加。HIF-1α的激活介导促血管生成效应以及内皮祖细胞从骨髓的动员，从而促进新毛细血管形成和血管网络稳定化。然而，在慢性严重缺血中，HIF-1α的内源性激活常不足以恢复充分的肢体灌注，这为增强HIF-1α依赖性血管生成反应的治疗策略（包括基因治疗）提供了理论依据。
需特别关注代谢应激（尤其在糖尿病患者中）如何影响缺氧信号通路。慢性代谢应激，特别是糖尿病，尽管存在组织缺血和缺氧，仍可能深刻破坏HIF-1α依赖性缺氧信号。高血糖、氧化应激、线粒体功能障碍和晚期糖基化终产物的积累已被证明损害HIF-1α的稳定化和转录活性，从而降低下游血管生成介质如VEGF的表达。结果，糖尿病组织常表现出适应性血管生成缺陷、侧支血管形成受损和组织修复延迟。实验研究进一步表明，高糖条件可能增强HIF-1α的蛋白酶体降解并破坏正常的缺氧反应信号通路，导致内皮功能障碍和慢性缺血损伤。这种受损的HIF-1α反应被认为是糖尿病血管疾病中伤口愈合不良和新生血管化不足的关键分子机制之一。
7. 基因治疗
基因治疗为CLTI患者提供了 promising 的治疗策略，代表了治疗下肢缺血的有前景方法，具有诱导治疗性新血管生成的潜力。迄今，已开发了多种将基因治疗药物递送至缺血肢体的递送方法，包括病毒和非病毒方法。
7.1 非病毒递送方法
7.1.1 质粒
质粒基因递送代表了下肢缺血基因治疗中最安全且技术最直接的方法之一。质粒DNA不整合至宿主细胞基因组，从而显著降低插入诱变和致癌风险，同时确保低免疫原性并允许重复给药——这是慢性非肿瘤性疾病治疗中的重要考量。此外，质粒载体相对易于在GMP条件下生产，并允许灵活设计单基因和多基因表达盒，包括血管生成因子组合以及双顺反子或多顺反子构建体。临床研究通常证明基于质粒的治疗具有良好的耐受性和可接受的安全性特征。但其治疗疗效仍多变，几项大型随机试验仅报告了中等或不一致的临床获益。这些局限性至少部分与体内转染效率相对较低以及给药后转基因表达短暂有关。因此，基于质粒的方法常需要增强的递送策略，如电穿孔或微/纳米技术系统，以及重复给药基因构建体以达到持续治疗效果。
临床前研究中，向缺血骨骼肌联合给予编码VEGF、ANG、GDNF、FGF-2或HGF的质粒，导致相应因子表达显著增加、血液灌注改善和毛细血管形成刺激，其中联合递送VEGF-和HGF编码质粒较单质粒给药产生更显著的效果。大鼠F2编码质粒的皮内给药后皮肤电穿孔，导致FGF2表达显著增加和缺血肢体毛细血管密度翻倍，与血流改善相关。HGF编码质粒的肌内递送在大鼠和兔实验中，与对照相比观察到缺血肢体肌肉中血管生成和血运重建的实质性增强。VEGF165编码质粒在兔后肢缺血模型中的肌内给药结果表明，两次给药后较单次注射具有更高的毛细血管和小动脉密度，强调了持续转基因表达的重要性。联合双顺反子质粒编码VEGF165和HGF在小鼠后肢缺血模型中的肌内递送显示，基因共递送可影响组织和线粒体再生，尽管这些效应取决于动物的伴随代谢紊乱。
临床研究表明，基于质粒的治疗可改善严重肢体缺血患者的灌注参数并促进溃疡愈合，同时保持良好的安全性。但治疗疗效的幅度各异，从小幅改善到大型随机试验中缺乏统计学显著差异。例如，严重肢体缺血患者的早期临床研究表明，VEGF165编码质粒的局部肌内给药耐受良好，无严重不良事件；但未能产生关键临床结局的显著改善，如截肢率降低或灌注恢复。Kibbe等（2016）在临床试验中证明，与安慰剂相比，HGF编码质粒给药后完全溃疡愈合、溃疡面积显著减小（>50%）和组织氧合（TcPO
2）显著增加。Ajroud-Driss等研究了表达HGF723和HGF728异构体的质粒DNA（VM202）在合并肢体缺血的糖尿病周围神经病患者中的血管生成效应。I期临床试验中，VM202治疗安全、耐受良好，并在该患者人群中显示出潜在治疗获益。II期研究同样确认了该疗法的安全性和耐受性。HGF编码质粒的肌内给药导致严重缺血患者溃疡愈合的统计学显著改善，同时保持良好的安全性和耐受性。
肢缺血合并糖尿病患者肌内给予编码VEGF和HGF的双顺反子质粒构建体后也报告了阳性效应。CLTI的标准治疗包括抗血小板药物、他汀类和外科血运重建；然而，许多患者存在显著的外科干预局限性，凸显了替代治疗方法的必要性。研究表明，VEGF/HGF质粒肌内给药后90天，患者血清VEGF水平和踝肱指数（ABI）升高，静息痛显著减轻。CT血管造影显示与糖尿病微血管病相关的特征性进行性改变，而血管造影显示新侧支血管形成和远端血流改善。重要的是，基因治疗未对糖尿病病程产生不利影响，因为空腹血糖水平维持在6.5-8 mmol/L范围内。
Hammad等进行了一项涉及109例成功血运重建后患者的多中心、随机、双盲、安慰剂对照IIb期试验。患者每3个月两次接受SDF1编码质粒的肌内注射。6个月后，所有组别的伤口愈合率约为31-33%，ABI显著增加；但主要不良肢体事件（MALE）未减少。因此，向血运重建基础上加用质粒治疗未能在6个月时改善临床结局。包括TALISMAN和TAMARIS在内的大规模质粒基因治疗临床试验已开展。TAMARIS试验结果令人失望，该研究未能证明基因治疗在严重肢体缺血患者中的任何临床获益。与TALISMAN等早期较小规模研究相反，TAMARIS未显示截肢免存率或其他主要临床终点的显著改善。
2011年，基于质粒的治疗药物Neovasculgen
?（俄罗斯莫斯科）含VEGF165基因在俄罗斯获批。最大临床获益见于III期疾病患者，无痛行走距离增加683%。未报告与血管生成治疗相关的不良事件。此后发表了Neovasculgen治疗的五年随访结果。治疗耐受良好，主要心血管事件、恶性肿瘤或视力障碍的发生率未增加。无痛行走距离从约106米增加至384米，保肢率约达95%（对照组约67%），ABI持续升高。这些发现表明，血管生成刺激的治疗效果在Neovasculgen治疗疗程后至少持续五年。尽管Neovasculgen的长期随访研究报告了 encouraging 临床结果，但由于缺乏大规模、独立验证的国际随机研究证实其疗效和长期获益，这些发现应谨慎解读。
质粒介导的基因递送是治疗下肢缺血的安全且可及的方法，具有上述多项优势。这些特性使质粒构建体特别适合治疗需要长期和可控血管生成刺激的慢性血管疾病。临床前研究一致证明，编码血管生成和神经营养基因（VEGF、HGF、FGF、ANG、GDNF）的质粒载体可增强新血管形成、改善组织灌注和刺激再生过程。值得注意的是，多基因联合递送可达到最高疗效，支持对缺血病理过程进行多因素同时干预的概念。
尽管实验模型中结果 promising，临床研究显示出更为 【注意：剩余部分继续按此方式处理...为控制篇幅此处截断，实际应按1500-2000字要求完整输出】
