巨噬细胞微环境（Macrophage Niche）的重建揭示肾脏驻留巨噬细胞（Renal-resident Macrophage, RM）与肾小管上皮细胞的动态转录及细胞间通讯网络

《Cells》：The Reconstitution of the Macrophage Niche Reveals Dynamic Transcriptional and Renal Macrophage–Epithelial Communication Networks

　　

肾驻留巨噬细胞（Renal-resident macrophage, RM）是维持肾脏稳态与修复的关键调节因子，然而RM微环境（niche）在急性耗竭后再生的分子机制尚不清楚。研究人员建立了可诱导的人CD59-中间溶血素（human CD59-intermedilysin, hCD59-ILY）消融系统，可快速、特异且可逆地耗竭靶巨噬细胞群体，随后监测RM的补充，并对基线及巨噬细胞消融后第1、3、7天（D1/D3/D7）的肾脏进行纵向单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析。RM消融触发近端小管上皮细胞（Proximal Tubular Epithelial Cell, PTC1/PTC2）中Cx3cl1的持续上调，形成持久的趋化微环境信号并与巨噬细胞再群体化同步。再生的RM从炎症/应激相关状态向富含糖酵解、氧化磷酸化、MYC及细胞周期程序的代谢活跃和增殖表型转变，经典炎症通路衰减。细胞-间通讯分析显示D1出现早期信号爆发，随后渐进恢复正常，纤连蛋白（Fibronectin, Fn1）、骨桥蛋白（Osteopontin, Spp1）、趋化因子（Ccl）及淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein, App）轴是微环境恢复的关键介质。转录调控网络分析鉴定出一个保守调控模块（Tfe3、Mitf、Hif1a、Myc、Gabpa、Rcor1）协调巨噬细胞分化与再生程序，将代谢适应与谱系重建相关联。亚群分析揭示5个动态变化的RM子集，体现层级再生过程。研究人员使用氯膦酸盐脂质体耗竭骨桥蛋白缺陷（Secreted Phosphoprotein 1, Spp1/Opn?/?）小鼠证实Spp1介导的巨噬细胞-上皮细胞通讯驱动微环境恢复及小管修复，Spp1缺失导致RM再群体化受损。综上，本研究定义了一个由上皮细胞CX3CL1信号、巨噬细胞代谢重编程及Spp1依赖信号共同协调的上皮-免疫回路，调控急性免疫细胞消融后的巨噬细胞微环境重建与肾脏修复。

《巨噬细胞微环境重建揭示肾驻留巨噬细胞-上皮细胞动态转录与通讯网络》论文解读

本研究发表于Cells期刊。目前关于肾驻留巨噬细胞（Renal-resident Macrophage, RM）在急性耗竭后微环境（niche）再生的时序机制及细胞间通讯层次尚不明晰，传统耗竭模型（如氯膦酸盐脂质体、白喉毒素受体DTR模型）存在消融不完全、脱靶毒性及激活代偿性造血等局限，阻碍了对其再生动力学的无偏分子解析。研究人员开发了hCD59-中间溶血素（intermedilysin, ILY）诱导性巨噬细胞特异性消融系统，结合高通量单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与细胞-细胞通讯（Cell-Cell Communication）映射，旨在阐明RM耗竭、微环境再群体化、转录激活及细胞互作的时间动力学与信号层级，明确调控RM再生的上皮-免疫回路及核心转录因子网络，并验证关键分泌因子骨桥蛋白（Secreted Phosphoprotein 1 / Osteopontin, Spp1/OPN）的功能。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：构建Cx3cr1^CreER+/?/ihCD59^+/?基因工程小鼠模型，经他莫昔芬（Tamoxifen）诱导及ILY注射实现RM特异性急性耗竭与再生；设置基线（D0）及消融后D1、D3、D7四个时间点收取肾脏组织，进行scRNA-seq（10× Genomics平台，Cell Ranger比对，Seurat包质控、降维、聚类与注释）；采用CellChat（v2.1.0）推断细胞-细胞通讯网络；应用pySCENIC进行转录因子（Transcription Factor, TF）调控子（regulon）分析；使用氯膦酸盐脂质体耗竭野生型（C57BL/6）及Spp1^?/?（Opn^?/?）小鼠RM并以流式细胞术检测再群体化；通过RT-qPCR验证Cx3cl1表达；采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA, clusterProfiler）鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Gene, DEG）相关Hallmark通路。

3.1. ScRNA-Seq Reveals Rapid Renal Macrophage Ablation, Regeneration, and Coordinated Kidney-Wide Transcriptional Remodeling

流式细胞术证实ILY注射后D1 RM（CD11b⁺F4/80^hi）特异性耗竭，D3开始恢复（约25%基线），D7达约75%。scRNA-seq显示髓系细胞中巨噬细胞比例从D0的84.65%降至D1的48.08%，D3恢复至74.91%，D7为75.51%。RT-qPCR及单细胞图谱显示Cx3cl1在近端小管上皮细胞（PTC1、PTC2等）持续上调（D1–D7），证实肾小管上皮是RM耗竭后产生趋化信号CX3CL1的主要细胞源。再生的RM上调炎症/应激相关及增殖基因（S100a8、Lcn2、Rrm2、Cdc6等），下调Il10等稳态基因；Hallmark富集显示糖酵解（Glycolysis）、氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）、MYC靶、E2F靶、G2M检查点及未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）上调，而TNF-α/NF-κB及IL6-JAK-STAT3等经典炎症通路相对下调，表明再生RM获得代谢活跃、增殖倾向的修复表型而非持续促炎表型。

3.2. Major Cell-Cell Communication Dynamics Following RM Ablation

CellChat分析显示整体细胞间通讯强度D1达峰、D3降低、D7部分恢复。RM与上皮细胞（PTC2、远曲小管DTC、髓袢升支LOH）及免疫细胞（中性粒细胞、T细胞）互作增强。SCENIC鉴定出18个再生期活性升高的TF，核心模块为Tfe3、Mitf、Hif1a、Myc、Gabpa、Rcor1，与髓系分化及代谢-增殖重编程相关。STRING整合显示TF与CellChat鉴定配体（Spp1、Fn1、App、Ccl6、Ccl9）具显著蛋白互作（Protein-Protein Interaction, PPI富集p=7.66×10^?12），涉及白细胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）响应及髓系分化程序。关键配体-受体轴包括RM自分泌Fn1-Cd44及Spp1-Cd44；RM至免疫细胞Fn1-Cd44/Spp1-Cd44及Ccl9-Ccr1；RM至上皮细胞Fn1-Sdc4及Fn1-整合素（Itgav+Itgb6/Itgb8）；早期趋化招募由Ccl6-Ccr2及Ccl9-Ccr1驱动。

3.3. Spp1 Signaling Promotes RM Regeneration Following Clodronate Induced Ablation

野生型C57BL/6小鼠注射氯膦酸盐脂质体后D2 RM减少约65%；WT小鼠D7 RM恢复近基线，而Spp1^?/?（Opn^?/?）小鼠RM再群体化显著受损、持续低于WT对照，证实Spp1（OPN）-Cd44信号是RM微环境重建与再群体化的关键驱动因子。

3.4. Dynamic Remodeling of Renal Macrophage Subsets and Cell–Cell Communication Following Macrophage Ablation

对RM进行亚群分群鉴定出5个动态子集：Fn1⁺Cd11b⁺（组织重塑/促纤维化"builder"巨噬细胞，高表达Fn1、Spp1、Arg1）、Pglyrp1⁺Ace⁺（免疫调节/抗菌，高表达Ace、Nr4a1）、Ccr2⁺Ly6c2⁺（单核细胞来源炎性，高表达Ccr2、Ly6c2）、Mmp13⁺Ccl12⁺（细胞外基质ECM重塑与趋化，高表达Mmp13、Mrc1）、Ly6c1⁺Adgrf5⁺（niche监视/"sensor/guardian"，高表达Ly6c1、Egfl7）。Fn1⁺Cd11b⁺与Mmp13⁺Ccl12⁺在D1达峰后下降，Pglyrp1⁺Ace⁺与Ccr2⁺Ly6c2⁺D1减少而后扩增接近基线，符合单核细胞招募-分化的层级修复过程。亚群水平CellChat显示：D1以Fn1⁺Cd11b⁺RM为主要信号发送者；D3以Ccr2⁺Ly6c2⁺RM为中枢；D7 Fn1⁺Cd11b⁺RM再次主导，靶向PTC2亚型及RM子集；Pglyrp1⁺Ace⁺RM富集Sirpb信号及App-Cd74互作，具独特免疫调节程序。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究利用hCD59-ILY系统明确了CX3CL1主要由耗竭后近端小管上皮持续分泌并驱动RM趋化与滞留；再生RM呈现代谢重编程（糖酵解/氧化磷酸化/MYC-E2F）伴随炎症通路抑制的修复表型；Spp1-Cd44与Fn1-整合素/CD44是RM-上皮/免疫细胞互作的核心轴，其中Spp1对损伤后而非稳态下的RM再生至关重要；Tfe3/Mitf/Hif1a/Myc/Gabpa/Rcor1模块耦合代谢-分化程序调控niche重建；RM五个子集按时序切换主导信号（早期Fn1⁺Cd11b⁺，中期Ccr2⁺Ly6c2⁺，晚期Fn1⁺Cd11b⁺）协调近端小管上皮（尤其是PTC2）修复。

结论翻译：肾巨噬细胞（RM）急性耗竭启动高度协调的再生程序，通过Ccr2⁺Ly6c2⁺、Pglyrp1⁺Ace⁺及Fn1⁺Cd11b⁺等离散巨噬细胞子集的顺序招募与分化实现微环境快速重建。整合单细胞转录组与细胞-细胞通讯分析确定耗竭后RM成为主导信号枢纽，经由Spp1-Cd44及Fn1-整合素等关键配体-受体通路与免疫细胞及近端小管上皮细胞（Proximal Tubular Epithelial Cell, PTE）进行双向动态互作。上述发现确立肾巨噬细胞再群体化为一个受转录因子调控、通讯驱动的过程，同步化免疫-上皮网络以恢复肾脏微环境完整性，为增强再生及限制纤维化的治疗靶点提供了机制依据。未来需在慢性损伤模型、代谢扰动及人肾活检/类器官中进一步验证巨噬细胞-上皮通讯在人疾病中的保守性与转化价值。