MerTK受孤儿核受体4A1（NR4A1）和NR4A2调控在结肠癌细胞中

《Cancers》：MerTK Is Regulated by Orphan Nuclear Receptor 4A1 (NR4A1) and NR4A2 in Colon Cancer Cells

　　

背景/目的：孤儿核受体4A1（NR4A1）和NR4A2在多种实体瘤中过表达，且两种受体均表现出肿瘤启动子样活性。近期一项研究报告指出，木犀草素（luteolin，一种结合NR4A1的黄酮类化合物）可降低结肠癌细胞中促癌受体酪氨酸激酶MerTK的表达。方法/结果：在本研究中，研究人员观察到MerTK蛋白在人SW480和HCT116以及小鼠CT26结肠癌细胞系中表达，并且在经过双NR4A1/NR4A2配体——1,1-双(3′-吲哚基)-1-(3,5-二取代苯基)甲烷（DIM-3,5）化合物处理后显著下调。此外，敲低NR4A1和NR4A2也降低了MerTK蛋白表达，而DIM-3,5配体及受体敲低也降低了MerTK RNA水平表达。通过敲低Sp1、Sp3或Sp4以及用光神霉素（mithramycin）处理，MerTK表达也被下调。后续使用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）和转染含有转录活性GC-rich启动子元件的MERTK（启动子）-荧光素酶构建体的研究表明，结肠癌细胞中MerTK的表达受NR4A/Sp复合物（包括NR4A1、NR4A2、Sp1、Sp3和Sp4转录因子）调控。结论：NR4A1和NR4A2参与MerTK的调控表明，DIM-3,5配体代表了一类新型药剂，可通过作为双NR4A1和NR4A2反向激动剂来抑制癌细胞中MerTK的表达。

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#### 一、研究背景、问题与意义

酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）TAM亚家族包括Tyro3、AXL和Mer（即MerTK），在凋亡细胞清除、免疫应答、病毒进入、血管功能及促癌活动中发挥多重作用。TAM受体在多种癌症中过表达，MerTK作为其中一员，在结肠癌中同样高表达，并与不良预后相关。目前针对MerTK的治疗策略主要集中于阻断配体-受体相互作用、抑制激酶活性或诱导受体降解，但通过转录水平抑制MerTK基因表达的方法尚未被充分探索。孤儿核受体4A1（NR4A1，亦称Nur77）和NR4A2（亦称Nurr1）在多种实体瘤中过表达，并展现出促癌活性。本实验室前期研究发现，双吲哚衍生物CDIM可结合NR4A1和NR4A2，作为反向激动剂抑制其下游促癌基因。近期有报道指出，结合NR4A1的黄酮类化合物木犀草素可降低非小细胞肺癌细胞中MerTK表达，提示NR4A1可能参与MerTK调控。鉴于MerTK此前被鉴定为Sp1调控基因，且NR4A1和NR4A2可作为Sp转录因子的配体依赖性辅因子，研究人员提出假说：在结肠癌细胞中，MerTK受NR4A/Sp复合物调控，而双NR4A1/NR4A2配体DIM-3,5化合物可作为反向激动剂抑制MerTK表达。该研究旨在阐明这一调控机制，为靶向MerTK提供新的转录控制策略。

#### 二、主要关键技术与方法

研究人员主要采用以下方法：1) **Western blotting**：检测人源SW480、HCT116及鼠源CT26结肠癌细胞系中MerTK、NR4A1、NR4A2等蛋白表达水平变化；2) **RT-qPCR**：定量分析MerTK mRNA表达；3) **RNA干扰**：使用siRNA或反义寡核苷酸分别敲低NR4A1、NR4A2、Sp1、Sp3、Sp4，评估对MerTK表达的影响；4) **荧光素酶报告基因实验**：转染含MERTK启动子（-388至0区域）的荧光素酶构建体于HCT116和CT26细胞，检测DIM-3,5配体及光神霉素（mithramycin）对启动子活性的影响；5) **染色质免疫沉淀（ChIP）**：在人HCT116和小鼠CT26细胞中检测NR4A1、NR4A2、Sp1、Sp3、Sp4与MERTK启动子GC-rich区域的结合变化；6) **免疫组织化学（IHC）**：对5例结肠癌患者肿瘤组织及配对正常毗邻组织（NAT）进行NR4A1、NR4A2、MerTK染色分析。此外，利用Kaplan–Meier Plotter公共数据库分析NR4A1和NR4A2表达与结肠癌患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的相关性。

#### 三、研究结果

**3.1 DIM-3,5类似物降低结肠癌细胞中MerTK蛋白表达**

研究人员用两种DIM-3,5双取代苯基类似物（DIM-3,5-Cl₂和DIM-3-Cl-5-CF₃）处理人SW480、HCT116及小鼠CT26结肠癌细胞系。Western blotting结果显示，DIM-3,5-Cl₂在高剂量下使MerTK蛋白水平分别降低59%、77%和83%；DIM-3-Cl-5-CF₃则分别降低80%、82%和89%。两种化合物均降低所有细胞系中NR4A1和NR4A2蛋白表达，其中DIM-3-Cl-5-CF₃诱导受体降解效果更强，且降解作用具有配体依赖性和细胞背景依赖性。

**3.2 NR4A1和NR4A2敲低降低MerTK表达**

通过RNA干扰敲低NR4A1或NR4A2，研究人员发现单敲低NR4A1可降低所有人源和鼠源结肠癌细胞中MerTK、NR4A1和NR4A2蛋白表达；单敲低NR4A2在SW480和HCT116细胞中降低MerTK、NR4A2和NR4A1表达，但在CT26细胞中NR4A1敲低未影响NR4A2水平。同时敲低NR4A1和NR4A2协同降低MerTK蛋白表达。此外，DIM-3,5-Cl₂处理及NR4A1或NR4A2敲低均显著降低MerTK mRNA水平（通过qPCR检测）。

**3.3 DIM-3,5类似物对下游靶点的影响**

研究人员检测了DIM-3,5类似物处理后MerTK下游靶点磷酸化mTOR（p-mTOR）和Bcl-2的表达。DIM-3,5-Cl₂处理降低p-mTOR/mTOR比率，提示mTOR活性下降；而DIM-3-Cl-5-CF₃处理的效应具有细胞背景依赖性。对Bcl-2表达，DIM-3,5-Cl₂仅在HCT116细胞中显著降低Bcl-2，DIM-3-Cl-5-CF₃则在三种细胞系中均显著降低Bcl-2。结果表明，DIM-3,5类似物对下游靶点的作用具有剂量依赖性和细胞背景依赖性，部分效应可能不仅源于MerTK下调，还涉及其他NR4A1/2调控通路。

**3.4 Sp转录因子参与MerTK调控**

光神霉素（Sp结合抑制剂）处理剂量依赖性地降低所有三种细胞系中MerTK表达。敲低Sp1、Sp3或Sp4均导致MerTK蛋白水平下降。这些结果表明Sp1、Sp3和Sp4均参与MerTK表达调控，与先前报道的NR4A1/Sp复合物调控模式一致。

**3.5 DIM-3,5类似物和光神霉素抑制MERTK启动子活性**

在转染MERTK启动子-荧光素酶构建体的HCT116和CT26细胞中，DIM-3,5-Cl₂和DIM-3-Cl-5-CF₃均显著降低荧光素酶活性。光神霉素处理同样剂量依赖性地降低启动子活性。这直接证实DIM-3,5化合物通过影响MERTK启动子活性抑制其转录。

**3.6 ChIP分析证实NR4A/Sp复合物与MERTK启动子结合**

ChIP实验结果显示，在人HCT116细胞中，NR4A1、NR4A2、Sp1和Sp4与MERTK启动子近端GC-rich区域结合；经DIM-3,5-Cl₂处理后，这些相互作用显著减弱。在小鼠CT26细胞中，同样检测到NR4A1、NR4A2、Sp1和Sp4结合，DIM-3-Cl-5-CF₃处理降低结合。此外，Sp3与小鼠MERTK启动子的结合也因处理而降低。这些结果与敲低实验和荧光素酶实验一致，表明NR4A/Sp复合物直接调控MerTK转录。

**3.7 临床样本分析**

对5例结肠癌患者肿瘤组织及配对正常毗邻组织（NAT）的免疫组化染色显示，肿瘤组织中NR4A1和MerTK表达显著高于NAT，而NR4A2表达在肿瘤中变异较大，未呈现一致差异。Kaplan–Meier生存分析表明，NR4A1和NR4A2高表达与结肠腺癌患者较低的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）显著相关（NR4A1 OS p=0.01，RFS p=8.5×10^-5；NR4A2 OS p=0.0022，RFS p=8.9×10^-5）。这提示NR4A1、NR4A2和MerTK均为结肠癌潜在治疗靶点。

#### 四、讨论与结论

讨论部分总结：MerTK是TAM家族促癌因子，在结肠癌中高表达且为阴性预后因子；NR4A1和NR4A2同样为促癌因子。研究人员证实DIM-3,5双NR4A1/NR4A2配体作为反向激动剂，通过破坏NR4A/Sp复合物与MERTK启动子的结合，抑制MerTK转录，从而降低其蛋白和mRNA表达。机制上，NR4A1和NR4A2作为Sp1、Sp3和Sp4的配体依赖性辅因子，共同调控MerTK表达。与既往在巨噬细胞中NR4A1以单体与NBRE元件结合不同，结肠癌细胞中MerTK调控主要依赖NR4A/Sp复合物。临床样本分析支持NR4A1和MerTK在结肠癌中的促癌作用。DIM-3,5化合物通过抑制NR4A1/2调控的增殖、存活、迁移、侵袭通路，并激活CD8⁺T细胞，同时降低包括MerTK在内的多种促癌因子表达，提供了基于转录控制的新型MerTK抑制策略。

研究结论（翻译）：总之，本研究表明，NR4A1/2/Sp(1-3)复合物调控结肠癌细胞中MerTK的表达。DIM-3,5双NR4A1和NR4A2配体作为反向激动剂下调MerTK表达。其机制涉及配体依赖性失活NR4A1和NR4A2，这两种受体作为Sp调控的MerTK表达的辅因子。DIM-3,5介导的MerTK基因抑制为在结肠癌细胞中抑制该激酶提供了一种基于转录控制的新方法，目前正在其他实体瘤来源的癌症中进行研究。