《Cancers》：Analysis of the Distribution of Lymph Node Metastases and Their Impact on the Prognosis in Ductal Adenocarcinoma of the Distal Part of the Pancreas—A Single-Center Retrospective Study
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，其开发正在多种癌症类型中积极进行。然而，当前CAR-T细胞疗法依赖于离体（ex vivo）工程，这带来了显著的后勤、时间和生物学限制。体内（in vivo）CAR-T细胞工程正作为新范式出现，可能通过施用CAR编码载体直接重编程患者体内的免疫细胞来克服这些挑战。该方法代表了一种现成的自体免疫疗法。病毒工程和纳米技术的进展使得开发多种CAR递送平台成为可能，这些平台不仅能递送CAR构建体，还能促进基因编辑组分（如Cas9）的递送，从而实现更复杂的体内遗传修饰。其中一些方法已进入临床评估，并在血液系统恶性肿瘤中显示出有希望的早期结果，实体瘤的临床试验也在进行中。然而，将体内工程CAR-T细胞疗法应用于恶性胶质瘤仍基本未被探索，反映了与血液系统恶性肿瘤不同的挑战。在本综述中，研究人员讨论了这些挑战及应对它们的潜在策略，同时强调了体内CAR-T细胞工程的最新进展。
1. 引言（Introduction）
嵌合抗原受体（CAR）是合成融合蛋白，由抗原识别域（通常来自单链可变片段（scFv））连接至细胞内信号域（包括共刺激分子和CD3ζ
+）组成。CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得显著成功，但离体（ex vivo）制造过程劳动密集、耗时且成本高，限制了可扩展性和可及性。体内（in vivo）CAR-T细胞工程通过在患者体内直接生成CAR-T细胞，有望克服这些限制。病毒载体工程和纳米颗粒递送系统的进展，使体内基因疗法在神经退行性疾病和血友病中的临床转化成为可能，为癌症免疫疗法铺平了道路。体内CAR-T细胞工程不仅提供经济和后勤优势，还预期通过将基因递送至分化程度较低的T细胞并随后自然生理扩增，改善CAR-T细胞功能，并通过避免淋巴细胞耗竭增强安全性并保留天然免疫。该方法最初在血液系统恶性肿瘤中探索，现已扩展至实体瘤，其中恶性胶质瘤因其抗原异质性、免疫抑制微环境和有限的T细胞浸润而代表关键前沿。
2. 方法（Methods）
通过PubMed检索相关文献，使用“in vivo CAR”、“嵌合抗原受体”、“CAR-T”、“CAR-NK”、“CAR-巨噬细胞”、“胶质瘤”、“胶质母细胞瘤”、“病毒载体”和“纳米颗粒”等术语的组合。优先考虑截至2026年5月的同行评审出版物。通过筛选相关文章的引用确定额外参考文献。于2026年5月31日检索ClinicalTrials.gov，以识别体内CAR免疫细胞工程的临床试验，搜索字符串为(“CAR” OR “嵌合抗原受体”) AND “in vivo”。纳入招募状态为“招募中”、“活跃，未招募”或“已完成”的研究。对于ClinicalTrials.gov未提供的信息，从相应开发者的公开披露中获取平台特征、载体系统和靶抗原等细节。收集可用的临床结果数据，优先考虑同行评审出版物，其次为会议摘要。排除公司新闻稿以减少报告偏倚。
3. 恶性胶质瘤离体CAR-T细胞疗法的当前临床经验（Current Clinical Experience of Ex Vivo CAR-T Cell Therapy in Malignant Glioma）
离体工程CAR-T细胞疗法在恶性胶质瘤患者中的临床试验尚未取得与血液系统恶性肿瘤相当的持久临床反应和生存获益。频繁使用局部区域递送途径，包括脑室内（ICV）和瘤内给药，以增强跨越血脑屏障（BBB）的肿瘤归巢。例如，一项针对复发GBM患者靶向白介素-13受体α2（IL13Rα
2）和表皮生长因子受体（EGFR）的双顺反子CAR-T细胞ICV给药的I期试验中，18例患者接受治疗，客观缓解率仅为8%，而3级免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）发生率为56%。另一项靶向IL13Rα
2的局部区域递送CAR-T细胞治疗复发高级别胶质瘤的I期试验中，57例患者接受治疗，客观缓解率仅为5.2%，35%发生3级或以上不良事件。一项针对H3K27M突变弥漫性内生性脑桥胶质瘤（DIPG）的GD2靶向CAR-T细胞疗法（静脉（IV）和ICV给药）的I期试验中，13例患者入组，虽观察到可达100%的肿瘤缩小，但所有患者均出现肿瘤炎症相关神经毒性（TIAN），且50%的剂量水平2 IV输注患者发生3级或以上细胞因子释放综合征（CRS）。总体而言，有限疗效和显著毒性仍是恶性胶质瘤CAR-T细胞疗法的主要挑战。
4. 恶性胶质瘤CAR-T细胞疗法的耐药机制（Resistance Mechanisms to CAR-T Cell Therapy in Malignant Glioma）
恶性胶质瘤中CAR-T细胞疗法的主要障碍是多因素且高度关联的。耐药性源于患者相关因素、深度局部和全身免疫抑制、抗原异质性和逃逸，以及跨越BBB的受限归巢。在GBM中，标准治疗替莫唑胺（TMZ）化疗常导致长期严重淋巴细胞减少。GBM患者的淋巴细胞功能受损，包括增殖能力降低、细胞因子产生减少和T细胞耗竭特征。地塞米松治疗可诱导细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）表达，抑制T细胞增殖和分化。即使在未治疗状态下，脑肿瘤可诱导T细胞表面S1P1受体丢失，导致大量T细胞隔离于骨髓。此外，GBM主要影响老年患者，年龄相关T细胞功能障碍构成额外障碍。免疫抑制性肿瘤微环境和抗原异质性是两大耐药机制。GBM中大量免疫抑制性髓系细胞浸润，包括髓系来源抑制细胞（MDSCs），结合缺氧和营养缺乏条件，形成深度免疫抑制微环境，损害并耗竭肿瘤浸润CAR-T细胞。目前尚无靶抗原兼具肿瘤特异性和均匀表达。表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）在CAR-T细胞治疗后复发时可能丢失，突显抗原逃逸挑战。T细胞向脑部的归巢是另一主要挑战。BBB保护脑组织，虽然活化的中枢神经系统（CNS）抗原特异性T细胞可跨越BBB，但T细胞通常不易做到。近期临床试验中，ICV给药优于IV给药以改善CAR-T细胞递送至肿瘤。
5. 当前离体CAR-T细胞制造的限制（Limitations of Current Ex Vivo CAR-T Cell Manufacturing）
所有七种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CAR-T细胞产品均需自体离体工程。离体自体CAR-T细胞疗法面临多步制造流程的挑战：个体化生产劳动密集、耗时、需要专门设施并显著增加成本。获批CAR-T产品估计每患者超过50万美元，总费用超过100-150万美元。制造需数周，对快速进展肿瘤患者不便。FDA批准的方法使用慢病毒（LV）或逆转录病毒载体永久整合CAR转基因，导致CAR持续表达，因持续信号和细胞因子暴露使细胞更易耗竭和分化。长时间的体外操作和扩增增加T细胞耗竭和分化，降低持久性和长期疗效。制造变异性源于起始材料取决于患者免疫状态；经大量预处理或免疫功能低下患者常产生低质量T细胞，导致不一致的治疗结果。输注前需要淋巴细胞耗竭以防止宿主免疫排斥并创造有利环境，但淋巴细胞耗竭带来免疫系统抑制、严重感染、血细胞减少、血液学毒性、CRS和神经毒性高风险。
6. 体内CAR-T细胞工程的潜在优势（Potential Advantages of In Vivo CAR-T Cell Engineering）
体内工程CAR-T方法直接重编程宿主T细胞，依赖靶向基因递送载体（如病毒载体和纳米颗粒）的规模化生产，可在集中设施中大规模合成并严格验证，绕过离体制造中的漫长生产和质控步骤。这些产品可作为现成疗法储存，可能大幅缩短治疗时间。规模化集中制造可能降低生产成本，预计可降至每剂约5000美元。同种异体CAR-T方法虽可解决T细胞池减少问题，但面临基因组编辑损伤、宿主免疫清除导致的持久性降低及移植物抗宿主病（GVHD）风险。体内工程CAR-T疗法为自体，避免这些限制。它不要求完全淋巴细胞耗竭，可更好地保护患者免疫系统完整性，增强肿瘤表位扩散，缓解肿瘤异质性和抗原逃逸。其根本生物学优势在于在天然生理龛中重编程T细胞，保留更广泛、分化程度较低的T细胞库，跳过离体扩增使未刺激细胞保持优越内在适应性和增强抗肿瘤活性。然而，实现精确细胞类型特异性仍是中心挑战，需要精心设计递送系统以最小化肝脾脱靶转导。策略包括工程化载体表面表达T细胞特异性结合分子以及开发选择性转导T细胞的腺相关病毒（AAV）血清型。脱靶毒性可通过生物工程化载体逃避先天免疫清除（如整合CD47）来减轻。
7. 瞬时表达与稳定表达、位点特异性整合（Transient Expression vs. Stable Expression, Site-Specific Integration）
CAR在T细胞中的表达分为瞬时和稳定两类。瞬时表达通过非病毒方法（如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒和膜衍生颗粒）递送CAR-编码mRNA实现，表达快速（数小时内可检测，约24-48小时达峰）且短暂（数天内因mRNA降解和细胞分裂而下降），提供重要安全优势，特别适用于早期研究或靶抗原具有不确定性时。但持久性有限可能损害长期抗肿瘤免疫，可能需要重复给药，引发抗载体免疫反应、递送效率降低和累积神经炎症等担忧。稳定表达依赖慢病毒和γ-逆转录病毒载体介导的随机基因组整合，支持持久CAR表达和抗肿瘤活性。但带来制造复杂、成本高和插入突变风险（如T细胞淋巴瘤）等挑战。欧洲药品管理局（EMA）最近报告约42,500例CAR-T治疗患者中38例T细胞恶性肿瘤，强调长期监测重要性。持续CAR-T细胞持久性可能增加慢性毒性（CRS和持续脱靶效应），可通过诱导安全开关和可调调控元件解决。CRISPR/Cas9基因组编辑技术实现了CAR转基因向特定基因组位点（如T细胞受体α恒定（TRAC）位点）的靶向整合，减少持续信号、耗竭和插入突变风险，同时破坏内源性TCR信号。其他“安全港”位点如AAVS1和ROSA26也被探索。但靶向整合引入脱靶编辑、基因功能破坏和基因组不稳定性等新风险。
8. 体内CAR-T细胞工程平台（In Vivo CAR-T Cell Engineering Platforms）
多种载体平台已开发用于体内CAR-T细胞工程，其中LV载体和LNP目前临床最先进。
8.1 慢病毒（Lentivirus，LV）：LV载体能转导分裂和非分裂细胞，介导稳定基因组整合，实现长期CAR表达。通过整合替代病毒包膜蛋白（如Sindbis、Nipah或麻疹病毒）和靶向配体（如scFv或设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）），可提高T细胞特异性。但插入突变、复制能力病毒生成和脱靶转导风险仍需关注。
8.2 脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）：LNP介导mRNA递送，实现瞬时CAR表达，可控制CAR活性和毒性，重复给药可行。抗体偶联靶向LNP可选择性递送至CD8
+ T细胞。LNP合成制造、模块化、可快速重新设计，降低时间和成本。但高效选择性递送至T细胞仍具挑战，常蓄积于肝脏。瞬时表达可能限制长期疗效，需重复给药。
8.3 腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）：AAV载体以游离DNA形式维持，提供相对持久的转基因表达且插入突变风险低。不同血清型赋予不同组织嗜性。但包装容量有限（~4.7 kb），预存免疫可降低转导效率，重复给药受限。
8.4 聚合物纳米颗粒（Polymeric Nanoparticle）：阳离子聚合物（如聚乙烯亚胺（PEI）和聚（β-氨基酯）（PBAE））静电结合核酸。表面修饰（如聚乙二醇（PEG）涂层）改善生物相容性。抗CD3ε F(ab‘)
2片段可选择性转导T细胞。但转染效率低于病毒载体，肝脾脱靶摄取和聚乙二醇（PEG）抗体诱导仍是挑战。
8.5 膜衍生颗粒（Membrane-Derived Particle）：包括细胞外囊泡（EV）和病毒样颗粒（VLP），生物相容性高，免疫原性低。表面可工程化显示靶向配体。Cas9包被递送载体（EDV）可实现T细胞选择性位点特异性CAR整合。但颗粒成分异质性、GMP制造可扩展性和靶向精度受限。
8.6 生物材料支架（Biomaterial-Based Scaffolds）：可注射水凝胶和多孔支架（如胶原和海藻酸盐）可招募免疫细胞，支持慢病毒介导的内源性T细胞工程，局部释放CAR-T细胞。优势在于局部递送减少全身毒性，特别适合中枢神经系统恶性肿瘤。但临床就绪度较低，可扩展性和可重复性尚未解决。
8.7 病毒模拟融合纳米囊泡（Virus Mimetic-Fusogenic Nanovesicle，VMFN）：表达抗CD3 scFv和病毒融合蛋白的工程脂质膜纳米囊泡，通过膜融合将CAR蛋白直接转移至靶细胞膜，瞬时表达，避免基因组整合。但转导效率低、持久性有限，制造经验不足。
9. 评估体内工程CAR免疫细胞的临床研究（Clinical Studies Evaluating In Vivo-Engineered CAR-Based Immune Cells）
已有多项体内工程CAR免疫细胞疗法临床试验在血液系统恶性肿瘤中启动，初步数据开始出现。LV载体是主要基因递送平台，LNP研究也已启动。例如，ESO-T01（靶向BCMA的LV载体）I期试验中5例复发/难治性多发性骨髓瘤患者，CAR-T细胞在CD3
+ T细胞中比例达10.6-59.1%，总缓解率80%，60%发生3级CRS。KLN-1010（另一LV载体）I期试验中3例患者，CAR表达达22-72%，部分缓解，未出现ICANS。VivoVec平台（LV载体表达cocal糖蛋白和MDF蛋白）的UB-VV400和UB-VV110分别靶向CD22和CD19，I期试验正在进行。INT2104（LV载体表达Gen2.1融合蛋白和CD7抗体）可生成CAR-T和CAR-NK细胞。非病毒平台如MT-302（LNP包裹TROP-2 CAR mRNA）通过被动靶向递送至巨噬细胞，I期试验中27例患者，52%发生CRS但无3级以上，1例4级ICANS，最佳部分缓解持续16个月。MT-303（靶向GPC3）和MT-304（靶向HER2）的研究也在进行。总体而言，体内工程CAR-T方法在血液系统恶性肿瘤中展示可行性和治疗前景，但临床数据仍早期有限。
10. 将体内工程CAR免疫细胞疗法应用于恶性胶质瘤的挑战（Challenges of Applying In Vivo-Engineered CAR-Based Immune Cell Therapies to Malignant Glioma）
恶性胶质瘤的功能性T细胞池减少对依赖患者免疫细胞的疗法尤为关键。体内工程的现成特性使治疗策略更灵活，如术后早期辅助治疗或术前新辅助治疗。为应对免疫抑制微环境和抗原异质性，瞬时表达平台（如LNP）可能通过重复给药持续产生新CAR-T细胞，对抗肿瘤微环境中的功能抑制。重复给药也可适应肿瘤进化和抗原异质性，如根据复发抗原谱重新设计载体或使用混合LNP制剂实现多靶向策略。未来疗法还需应对空间侵袭性肿瘤生态系统和胶质瘤干细胞群体（由Notch等信号通路维持）导致的细胞可塑性和抗原多样化。组合策略靶向间充质转化、细胞外基质重塑或侵袭相关微环境可能增强控制能力。体内工程CAR-T细胞通过全身循环到达脑肿瘤，需设计增强归巢能力的方法，如表达趋化因子受体（如CXCR3）或CXCR1/2。CAR-巨噬细胞方法因巨噬细胞固有的肿瘤归巢优势正引起关注：髓系细胞在GBM微环境中丰富浸润，表达高水平的CCR2和CSF1R，有利于向脑肿瘤招募。CAR-NK细胞疗法具有固有抗肿瘤活性和有利安全性，但持久性和扩增有限。局部区域递送策略（如纳米颗粒或生物材料支架直接注入肿瘤或切除腔）可改善载体滞留并减少脱靶暴露。低强度脉冲超声（LIPU）可暂时开放BBB，增强CAR-T细胞归巢。综上，开发脑肿瘤体内工程CAR-T疗法需整合优化载体设计、增强归巢能力、替代免疫细胞平台和调节BBB的综合策略。
11. 恶性胶质瘤体内工程CAR-T细胞疗法的潜在联合策略（Potential Combination Strategies for In Vivo-Engineered CAR-T Cell Therapy in Malignant Glioma）
恶性胶质瘤的高度耐药性使得联合策略可能必要。与免疫检查点抑制剂（ICIs）联合，特别是PD-1阻断，虽在离体CAR-T研究中显示可行但疗效有限，可能与GBM中多种免疫抑制机制有关。新辅助免疫检查点阻断可能有益，体内工程平台的可及性和重复给药可行性为灵活联合提供机会。溶瘤病毒可直接裂解肿瘤细胞，促进局部炎症、抗原释放和激活内源性抗肿瘤免疫，增强CAR-T细胞归巢和功能。免疫刺激和细胞毒性双载体基因疗法（如HSV1胸苷激酶（HSV1-TK）和FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3L））可协同促进抗原释放和树突细胞招募，创造更允许的微环境。
12. 结论（Conclusions）
自首款CAR-T疗法获批近十年来，离体工程关键限制日益凸显。病毒工程和纳米技术的进展使体内基因疗法临床转化，将体内CAR-T细胞工程定位为有希望的新治疗范式。早期临床数据已出现，其向实体瘤的应用正在进行中。开发针对恶性胶质瘤的方法需利用体内CAR-T细胞工程的后勤和生物学优势，精确理解治疗恶性胶质瘤的独特挑战并实施策略。有前景的方法包括优化CAR设计（如CXCR3工程化CAR-T细胞增强肿瘤归巢）、联合LIPU与CAR-T或CAR-巨噬细胞疗法，以及优化治疗时机（如围手术期或术后早期给药）以最大化疗效。
