《Microorganisms》：Screening of Marine Bacteria for Lipase Activity and Application as Whole-Cell Biocatalysts
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多种策略可用于新型微生物脂酶（Lipase）的鉴定。尽管宏基因组学（Metagenomics）在生物勘探中的重要性日益增加，但重组蛋白（特别是脂酶）的表达仍存在显著局限性。因此，基于培养的生物勘探方法仍具有重要价值。本研究中，研究人员通过培养方法筛选了主要来源
多种策略可用于新型微生物脂酶（Lipase）的鉴定。尽管宏基因组学（Metagenomics）在生物勘探中的重要性日益增加，但重组蛋白（特别是脂酶）的表达仍存在显著局限性。因此，基于培养的生物勘探方法仍具有重要价值。本研究中，研究人员通过培养方法筛选了主要来源于海洋的细菌分离株库，以检测脂酶活性。筛选在含有橄榄油乳剂和罗丹明B的固体培养基上进行脂解细菌筛选。阳性分离株随后在液体培养基中培养以确认脂酶产生。尽管培养上清液中未检测到脂酶活性，但所产生物质对三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯等甘油三酯底物表现出显著的水解活性。六株高活性分离株被表征为全细胞生物催化剂，发现它们在25至65°C温度和pH 6至10.5范围内均具有活性。其中两株革兰氏阴性产脂酶分离株的基因组分析揭示了几种编码脂解酶的推测基因，包括通过机器学习工具预测的胞外细胞结合酶。因此，这些含有细胞结合脂酶的天然分离株在全细胞生物催化剂应用方面具有特殊意义。
**研究背景与意义**
脂酶（三酰甘油酰基水解酶，EC 3.1.1.3）作为一类重要的水解酶，已被广泛应用于多种工业过程，包括洗涤剂添加剂、结构脂质生产以及光学纯活性化合物的合成等。脂酶能够催化中链和长链、水不溶性酰基甘油的水解反应，在有机溶剂体系中还可催化酯化和转酯化反应，常表现出立体选择性。然而，脂酶与其他羧酸酯水解酶（如酯酶、角质酶和磷脂酶）存在底物选择性重叠，使得这类酶的分类较为复杂。
微生物脂酶的生物勘探策略主要包括基于培养的非依赖方法（宏基因组学）和依赖培养的方法。尽管宏基因组学因下一代测序技术的进步、生物信息学工具的开发以及高通量筛选策略的应用而在酶生物勘探中日益重要，但重组酶在传统宿主如大肠杆菌中的表达常导致蛋白失活，即所谓"巨大的表达能力不足"问题。特别是细菌脂酶中属于脂酶家族I.1和I.2的成员，常需要特定分子伴侣才能达到最终活性构象。相比之下，在天然宿主中表达脂酶有助于确保产生活性酶，因此基于培养的生物勘探在组学时代仍具有重要价值。
海洋环境已被证明是新型生物催化剂和其他生物活性化合物的宝贵来源。高盐度、高压和极端温度等环境选择压力往往使这些微生物产生的酶具有广泛的耐受性。本研究团队在过去十年间建立了包含一千多种微生物分离株的菌株库，主要来自海洋环境及其他水生来源。基于此，研究人员假设所采样的海洋栖息地细菌分离株将表现出符合工业需求的脂解活性，因此设计本工作以筛选部分菌株库，寻找最适合进一步生物技术应用的全细胞生物催化剂。
**主要技术方法**
本研究的技术路线主要包括：（1）基于罗丹明B-橄榄油乳剂固体培养基的荧光筛选法，结合液体培养验证；（2）采用pH指示剂脂酶测定法（PHIBLA）定量检测生物量和培养上清液中的脂酶活性；（3）以对硝基苯丁酸酯（pNPB）为底物表征全细胞生物催化剂的pH和温度活性范围；（4）Sherlock?微生物鉴定系统基于脂肪酸甲酯（FAME）的气相色谱-氢火焰离子化检测（GC-FID）分析；（5）16S rRNA基因测序进行菌种鉴定；（6）两株高活性菌株的全基因组测序、注释及生物信息学分析，包括使用ESTHER数据库的HMMER工具进行α/β-水解酶超家族分类、DeepLocPro和SignalP预测亚细胞定位，以及InterProScan辅助功能注释。
**研究结果**
**海洋细菌脂酶产生菌的筛选**：对94株分离株进行脂酶产生筛选，其中44株在含罗丹明B的橄榄油乳剂固体培养基上呈现荧光反应。这些菌株的脂肪酸谱主成分分析（PCA）显示其分布于多个门，包括革兰氏阳性的芽孢杆菌门（Bacillota）和放线菌门（Actinomycetota），以及假单胞菌门（Pseudomonadota）的多个分支。阳性分离株在液体培养基中培养后，生物量对三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯均表现出显著活性，但培养上清液中未检测到脂酶活性，表明这些脂酶为细胞结合型。培养基组成对细胞结合脂酶的表达有显著影响，6株在固体培养基筛选中呈阳性的分离株在液体培养中未产生脂酶，14株仅表达酯酶，这可能与培养基中缺乏适当诱导物有关。
**脂解全细胞生物催化剂的表征**：从高活性菌株中选取分离株14、701、705、725、729和790进行进一步表征。通过16S rDNA测序鉴定，这些菌株均为革兰氏阴性γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），来自葡萄牙Guincho-Cabo Raso沿海临时岩石池的两个不同采样活动。其中三株Pseudoalteromonas分离株（701、705、729）因不能在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上生长而无法用Sherlock?系统鉴定，它们呈现不同的菌落表型：701为大型粉红色菌落，705为小型黄色菌落，729为小型白色菌落。705和729的16S rDNA序列相似性达98.86%，结合菌落表型可判定为P. undina的不同但共存的菌株。
全细胞生物催化剂在25-65°C和pH 6-10.5范围内均保持活性。分离株14（Psychrobacter celer）和725（Psychrobacter sp.）的pH活性曲线相似，在pH 6时分别保留最大活性的50.4%和51.1%，最适pH分别为9和8.5；温度最适均为45°C，但725在高温下残留活性更高，65°C时保留80.3%最大活性。分离株790（Serratia quinivorans）的pNPB水解最适温度为45°C，最适pH为10.5，呈现碱性脂酶特性，这与该属已报道的脂酶特性有所不同。三株Pseudoalteromonas分离株具有相似的温度和pH活性曲线，701和705的最适温度可能高于65°C，729的最适温度为60°C；705和729各呈现两个pH活性局部最大值，分别位于pH 8.5和pH 10-10.5，提示至少存在两种不同性质的酶。
**基因组分析**：对分离株14和790进行全基因组测序。经CLC Genomics Workbench组装和Bakta平台注释后，通过HMMER工具（ESTHER数据库）和InterProScan对编码脂解酶的推测基因进行分析，并使用DeepLocPro和SignalP预测亚细胞定位。
分离株14的基因组中，Pclip-6被归类为脂解酶家族I.1成员，其上游60 bp处存在脂酶分泌分子伴侣编码序列，两者可能构成脂酶-周质分子伴侣对；Pclip-28属于家族IV，该家族在细菌中仅含酯酶；Pclip-3属于家族X.2，DeepLocPro预测其为胞外酶，但SignalP预测的脂蛋白信号肽提示其可能为锚定在外膜的酶。
分离株790的基因组中，Sqlip-4被归类为脂酶亚家族I.3成员，该亚家族通过I型分泌途径而非I.1和I.2亚家族的II型分泌途径进行分泌，缺乏N端信号肽；Sqlip-20被注释为"Outer membrane lipase/esterase"，属于GDSL水解酶（或SGNH水解酶）家族，含有自转运蛋白结构域，其乘客结构域转位后仍与自转运蛋白结构域相连，从而锚定于细胞表面。
**讨论与结论**
海洋环境已被证明是生物产物和生物催化剂的宝贵来源。本研究中，94株主要来源于海洋环境的分离株被筛选脂酶产生能力，25%的筛选分离株呈现细胞结合脂解活性，以三辛酸甘油酯水解为判定依据。六株来自临时岩石池的分离株呈现最高脂解活性，并被进一步表征为全细胞生物催化剂。这些分离株在广泛的pH和温度范围内保持活性，与其自然环境中的多变温度和培养基组成相适应，这种 resilience 在工业应用中具有重要价值。
基因组分析揭示了两株最高活性分离株中存在编码常规胞外"真正脂酶"的推测序列，以及共价结合于膜锚定物的假设脂解酶，后者可能是观察到的细胞结合活性的原因。细胞结合水解酶在海洋细菌碳代谢中起关键作用，因为海洋环境中有限的碳源常为必须水解后才能被细胞摄取的聚合物。将酶保留在细胞附近对浮游细菌尤为重要，因为它们缺乏生物膜提供的酶和水解产物扩散屏障。全细胞生物催化剂相比纯化酶具有降低生产成本等优势，提高工业应用价值。
然而，这些预测脂解酶的表达均未经过实验验证，液体培养生物量中的胞外脂酶活性仅是可能表达这些蛋白的唯一直接指标。未来需要进一步分离鉴定膜结合酶，或在异源宿主中表达推测脂酶/酯酶基因，以验证其表达、亚细胞定位和活性。此外，仍需评估这些生物催化剂对工业相关底物的亲和力，以及在反应器条件和有机溶剂体系中的稳定性，才能全面评估其工业应用潜力。
本研究的目标——鉴定新型脂解生物催化剂——已实现，共获得六株具有广泛温度和pH活性范围的脂解全细胞生物催化剂。全细胞可能保护酶免受恶劣环境/反应条件的影响，从而拓宽应用范围。基因组分析揭示的序列可用于重组脂酶生产，在纯化酶催化策略与全细胞生物催化剂之间建立了桥梁。
**研究结论**
海洋环境已被证明是生物产物和生物催化剂的宝贵来源。本工作中，94株主要来源于海洋环境的分离株被筛选脂酶产生能力。共25%的筛选分离株呈现细胞结合脂解活性，由脂酶底物三辛酸甘油酯的水解确定。其中六株来自临时岩石池的分离株呈现最高脂解活性，并被进一步表征为全细胞生物催化剂。与其自然环境中多变的温度和培养基组成相适应，这些分离株在广泛的pH和温度范围内保持活性。这种耐受性在工业应用中具有不可估量的价值。然而，仍需进一步表征这些生物催化剂，例如评估其对工业相关底物的亲和力，以及在反应器条件和有机溶剂体系中（生物）酯化反应所需的稳定性，以评估其对工业过程的适用性。
两株最高活性分离株的基因组分析揭示了编码常规胞外"真正脂酶"的推测序列，以及可能共价结合于膜锚定物的假设脂解酶，后者可能是观察到的细胞结合活性的原因。必须注意的是，这些预测脂解酶的表达均未经过实验验证，液体培养生物量中的胞外脂酶活性仅是这些蛋白中一种（或多种）可能表达的唯一直接指标。未来的工作应聚焦于这些分离株中膜结合酶的分离鉴定，和/或推测脂酶/酯酶基因在异源宿主中的表达，以验证本研究中提出的推测脂解酶的表达、亚细胞定位和活性。尽管如此，本研究的目标——鉴定新型脂解生物催化剂——已经实现，共选择了六株具有广泛温度和pH活性范围的脂解全细胞生物催化剂。事实上，全细胞可能保护酶免受恶劣环境/反应条件的影响，可能导致更广泛的应用。此外，互补的基因组分析揭示了重组脂酶生产所需的序列，在纯化酶催化策略和全细胞生物催化剂之间架起了桥梁。
