蛋白磷酸酶5（Protein Phosphatase 5, PP5）通过促进SUMM2蛋白积累正向调控SUMM2介导的植物免疫

《Plants》：Protein Phosphatase 5 Promotes SUMM2-Mediated Immunity by Facilitating Its Protein Accumulation

　　

蛋白磷酸酶5（Protein Phosphatase 5, PP5）是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，具有独特的四肽重复（tetratricopeptide repeat, TPR）结构域，在哺乳动物中被证实参与多种细胞过程，但其在植物中的功能尚不清楚。本研究发现，拟南芥PP5是核苷酸结合亮氨酸富集重复（nucleotide-binding leucine-rich repeat, NLR）免疫受体SUMM2介导免疫应答所必需的。PP5功能缺失突变可抑制因MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4激酶级联被破坏而导致SUMM2激活所引起的自身免疫表型。进一步生化分析表明，SUMM2与热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90, HSP90）及PP5发生相互作用，且pp5敲除突变体中SUMM2蛋白水平降低，提示PP5通过与HSP90分子伴侣复合体相关联，促进SUMM2的蛋白积累。

论文解读：蛋白磷酸酶5（PP5/SUMM5）通过促进SUMM2蛋白积累正向调控SUMM2对MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4激酶级联的监控及免疫激活

一、研究背景与立项依据

植物通过两层免疫系统抵御病原菌侵染：PAMP触发免疫（PAMP-triggered immunity, PTI）与效应蛋白触发免疫（effector-triggered immunity, ETI），后者主要由NLR（nucleotide-binding leucine-rich repeat）免疫受体介导。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4丝裂原活化蛋白（mitogen-activated protein, MAP）激酶级联不仅是基础抗性的关键模块，其完整性也被CC型NLR（CC-NB-LRR, CNL）蛋白SUMM2实时监控——该级联组分的缺失（如mekk1、mkk1 mkk2或mpk4突变）会触发SUMM2依赖的自身免疫反应。SUMM2通过感知CRCK3（CALMODULIN-BINDING RECEPTOR-LIKE CYTOPLASMIC KINASE 3，MPK4直接底物）去磷酸化状态而激活。NLR免疫受体的稳态受HSP90（Heat Shock Protein 90，热休克蛋白90）分子伴侣机器及其辅伴侣（co-chaperone，如RAR1、SGT1）严格调控，可分别促进或促进降解不同NLR，但SUMM2是否受特定辅伴侣调控尚属未知。PP5（Protein Phosphatase 5）是含N端TPR结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在动物中为HSP90辅伴侣，在植物中与光信号、耐热性及HSP90–SGT1–RAR1复合体相关，但其对NLR免疫的具体功能未明。本研究旨在鉴定SUMM2介导免疫的新调控因子并阐明PP5在其中的作用。该论文发表于《Plants》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员以拟南芥Col-0生态型为背景，利用mkk1-1 mkk2-1 ndr1-1三重突变体开展化学诱变抑制子筛选获得summ5-1突变体；通过图位克隆结合全基因组重测序及T-DNA插入突变体验证确定SUMM5基因为AT2G42810（编码PP5）；通过杂交构建mekk1-1 summ5-2、mpk4-3 summ5-2等多重双/多重突变体进行遗传分析；采用qRT-PCR检测PR1、PR2及SUMM2-HA转录水平，Western blot检测SUMM2-HA蛋白积累量；在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中进行瞬时表达及抗FLAG磁珠免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）验证SUMM2与PP5及HSP90的体内互作；构建催化位点突变体PP5^H344A并在summ5-2 mkk1 mkk2 ndr1-1背景下进行回补实验；通过丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato, P.s.t.）DC3000携带AvrRpt2/AvrRPS4/AvrPphB及hrcC缺陷株接种评估其他NLR介导ETI及PTI；通过寄生霜霉（Hyaloperonospora arabidopsidis, H.a.）Noco2喷雾感染评估抗病性。

三、研究结果

2.1. Identification and Characterization of summ5 mkk1 mkk2 ndr1

为克服mkk1 mkk2双重突变体不育限制，研究人员在mkk1-1 mkk2-1 ndr1-1背景中筛选到summ5-1抑制子。表型显示summ5-1 mkk1 mkk2 ndr1四重突变体比mkk1 mkk2 ndr1生长恢复，组成型高表达的PR1和PR2被显著降低，对H.a. Noco2增强抗性减弱，证明summ5-1部分抑制mkk1 mkk2 ndr1的自身免疫表型。

2.2. SUMM5 Encodes PROTEIN PHOSPHATASE 5 (PP5)

图位克隆将summ5-1定位至染色体2的17.6–18.7 Mb区间，全基因组重测序发现候选基因AT2G42750和AT2G42810有无义突变。仅AT2G42810（PP5）的T-DNA插入突变体（summ5-2/WiscDsLox368D06）可部分抑制mkk1 mkk2自身免疫表型及PR基因组成型表达；原生启动子驱动PP5-GFP回补summ5-1 mkk1 mkk2 ndr1恢复表型，确认SUMM5即AT2G42810/PP5，其含C端磷酸酶催化域和N端TPR域。

2.3. Defense Responses in mekk1 and mpk4 Are Partially Suppressed by summ5

构建mekk1-1 summ5-2和mpk4-3 summ5-2双突变体，发现summ5-2部分恢复mekk1和mpk4矮化表型并降低其组成型PR1/PR2表达，遗传学上证明PP5/SUMM5作用于MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4激酶级联下游、SUMM2介导免疫的上游或平行位置。

2.4. PP5 Affects the Accumulation of SUMM2

将35S::SUMM2-HA导入summ5-2背景，qRT-PCR显示SUMM2-HA转录水平在野生型和summ5-2中相当，但Western blot显示summ5-2中SUMM2-HA蛋白量显著下降，表明PP5在蛋白水平促进SUMM2积累而不影响转录。

2.5. SUMM2 Interacts with PP5 and HSP90 in Planta

在本氏烟草中共表达SUMM2-HA与PP5-FLAG-ZZ或HSP90-FLAG-ZZ，Co-IP显示SUMM2-HA可被抗FLAG珠下拉并与PP5及HSP90分别共免疫沉淀，证实SUMM2与PP5及HSP90在体内形成复合体。

2.6. Mutation of the Conserved Catalytic Histidine Does Not Impair PP5 Function in SUMM2-Mediated Defense

将催化关键残基H344突变为丙氨酸（PP5^H344A），转入summ5-2 mkk1 mkk2 ndr1背景可完全恢复mkk1 mkk2 ndr1矮化表型及PR1/PR2组成型高表达，说明磷酸酶活性对该免疫调控功能非必需，PP5可能以支架蛋白/辅伴侣方式发挥作用。

2.7. RPS4, RPS2- and RPS5-Mediated Defense Responses Are Not Affected in summ5 Mutants

P.s.t. DC3000(AvrRpt2/RPS2)、DC3000(AvrRPS4/RPS4)、DC3000(AvrPphB/RPS5)接种显示野生型与pp5突变体病原菌生长无差异，表明PP5不参与上述TIR-NLR或CNL介导的ETI。

2.8. PP5 Is Not Required for PAMP-Triggered Immunity

P.s.t. DC3000 hrcC（T3SS缺陷株，用于检测PTI）在pp5突变体与野生型中生长相当，表明PP5不参与PTI。

四、讨论与结论总结

研究人员先前建立SUMM2通过感知CRCK3磷酸化状态监控MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4级联完整性的模型。本研究发现SUMM5即PP5，是SUMM2介导免疫的正调控因子；pp5功能缺失部分抑制mekk1、mkk1 mkk2及mpk4自身免疫，且pp5中SUMM2蛋白水平降低。SUMM2与PP5及HSP90在体内互作，PP5可能作为HSP90辅伴侣促进SUMM2积累。催化关键残基H344突变体可回补pp5表型，提示PP5在此过程主要发挥非磷酸酶活性的支架/辅伴侣功能（尽管极低残留活性不能完全排除）。PP5仅部分抑制自身免疫且不影响RPS2/RPS4/RPS5介导ETI及PTI，暗示其具NLR-client特异性，为免疫受体稳态的辅伴侣特异性调控提供了证据。综上，蛋白磷酸酶5（PP5/SUMM5）通过与HSP90分子伴侣复合体相关联并促进SUMM2蛋白积累，特异性正向调控SUMM2对MEKK1–MKK1/MKK2–MPK4 MAP激酶级联完整性的监控及随后的NLR介导免疫激活，且不参与其他检测NLR介导的ETI及PTI。