人工饲料适口性不同的家蚕(Bombyx mori L.)品种中肠微生物多样性与血淋巴代谢组学分析

《Insects》：Analysis of Midgut Microbial Diversity and Hemolymph Metabolomics in Silkworm (Bombyx mori L.) Varieties with Different Artificial Diet Feeding Habits

　　

作为重要的人工饲料饲喂家蚕品种，优食一号(Youshi No. 1, YS)与广食一号(Guangshi No. 1, GS)在生理性状上存在显著差异。GS在家蚕体重、结茧能力、摄食量、饲料利用率及消化酶活性方面均显著优于YS。研究人员进一步采用代谢组学与16S rRNA高通量测序分析两品种的血淋巴代谢谱及中肠微生物群，筛选出40余种差异代谢物，经KEGG富集确定4条与摄食分化相关的代谢通路，其中L-缬氨酸(L-valine)于多条通路中富集。中肠微生物群结构亦存在显著差别，芽孢杆菌属(Bacillus)与泛酸(pantothenic acid)及缬氨酸代谢呈正相关。关联分析表明差异代谢物与肠道微生物群可能构成两品种表型变异的内在基础。整合分析与功能验证实验显示，人工饲料中添加1%(w/w) L-缬氨酸或特定Bacillus菌株与YS家蚕生长性能、茧质及饲料利用率的提升相关。

论文解读：人工饲料适口性不同的家蚕品种中肠微生物多样性与血淋巴代谢组学分析

该研究发表于《Insects》。目前对于不同人工饲料适应性家蚕品种间表型分化的研究多集中于遗传与分子层面，缺乏对其肠道微生物组结构及其与宿主代谢互作的系统性探究。鉴于肠道微生物群在动物营养、消化及免疫中的重要作用，以及氨基酸代谢（特别是支链氨基酸）与昆虫生长发育密切相关，研究人员以人工饲料适应性存在差异的两个家蚕品种——优食一号(Youshi No. 1, YS)和广食一号(Guangshi No. 1, GS)为对象，通过整合16S rRNA基因高通量测序与非靶向代谢组学技术，解析其中肠微生物群落结构与血淋巴代谢谱的差异，筛选关键差异代谢物与差异菌群，并通过外源添加验证关键因子对低适应性品种(YS)生长及茧质的改善作用，旨在揭示家蚕人工饲料适应性差异的肠道微生态与代谢机制。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：以实验室保存并杂交继代的YS与GS家蚕五龄幼虫为实验材料，设生物学重复；测定五龄期体重、摄食量、饲料利用率及茧质指标；测定中肠消化酶（α-淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶）活性及对应基因相对表达量(RT-qPCR)；取五龄第3天中肠进行16S rRNA基因(V3–V4区，引物338F/806R)扩增子高通量测序分析α/β多样性、菌群组成及相关功能预测(PICRUSt2)；取同期血淋巴进行非靶向代谢组学(LC-MS/MS)检测与KEGG富集分析；对差异代谢物与差异菌群做Spearman相关性分析；开展验证实验——在基础人工饲料(M20)中添加1%(w/w) L-缬氨酸(L-valine)饲喂YS及GS对照组，以及在饲料中添加浓度为10⁷CFU mL^?1的外源Bacillus velezensis C4-5、B. subtilis C17、B. rugosus WP-5菌液饲喂YS各组，测定体重与茧质变化。

3.1. Differences in Body Weight and Cocoon Quality Between Silkworm Varieties of YS and GS Reared on an Artificial Diet

通过对五龄期不同时间点体重测定及结茧后全茧重、茧层重、茧层率调查，研究人员发现GS五龄期平均体重(2.86 ± 0.04 g)极显著高于YS(2.35 ± 0.07 g, p < 0.001)；GS雌雄个体摄食量均显著高于YS；GS雌蛾五龄前期至中后期的饲料利用率也显著高于YS。GS全茧重、茧层重及茧层率均高于YS。表明GS对人工饲料的适应性及生长结茧性能优于YS。

3.2. Differences on Digestive Enzyme Activity and Gene Expression Levels Between Silkworm Varieties of YS and GS Reared on Artificial Diets

GS中肠α-淀粉酶(α-Amylase)、胰蛋白酶(Trypsin)及脂肪酶(Lipase)活性均显著高于YS；RT-qPCR显示GS中α-淀粉酶基因相对表达量为YS的3.58倍且与酶活趋势一致，而YS中脂肪酶与丝氨酸蛋白酶基因表达高于GS。提示消化酶活性的种间差异可能是造成两品种生长差异的重要因素之一。

3.3. Differences in the Midgut Microbiology Composition Between YS and GS Silkworm Varieties Reared on Artificial Diets

16S rRNA测序显示两品种中肠微生物α多样性无显著差异，但PCoA分析表明菌群结构明显分离。共有736个菌属，GS独有191个，YS独有163个。属水平优势菌均为假单胞菌属(Pseudomonadaceae_Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)和Faecalibacterium；与YS相比，GS中Pseudomonas相对丰度升高，Lactobacillus降低。LEfSe分析鉴定GS中Phenylobacterium、Thermomonas、Nitrospira等为特征菌，YS中Lactobacillus、Ramlibacter等为特征菌。PICRUSt2功能预测显示YS组RUMP-PWY、PWY-1861、PWY-6350等代谢通路显著下调，暗示YS微生物群对外源物质代谢解毒及代谢活力较低。

3.4. Differences in Metabolic Pathways Between YS and GS Silkworm Varieties Reared on an Artificial Diet

血淋巴非靶向代谢组OPLS-DA显示两组样本明显分离，鉴定出40种差异代谢物，GS中28种上调、12种下调。KEGG富集最显著通路包括苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、生物素合成及不饱和脂肪酸合成等。GS血淋巴中环己胺(Cyclohexylamine)、L-缬氨酸(L-Valine)、L-组氨醇(L-Histidinol)及L-甘氨酸苷(L-Glycitin)相对含量较高。L-缬氨酸富集于缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(Val/Leu/Ile)生物合成与降解、泛酸(Pantothenic acid)与辅酶A(Coenzyme A, CoA)生物合成、ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)及氨酰-tRNA生物合成等多条差异通路，被研究人员判定为潜在关键代谢物。

3.5. Bacillus Showed a Positive Correlation with Valine Metabolism

Spearman相关性分析表明，L-缬氨酸与26个差异菌属呈显著正相关，其中包括芽孢杆菌属(Bacillus)；泛酸与25个差异菌属呈显著正相关。GS组中Bacillus相对丰度显著高于YS，且Bacillus与泛酸及L-缬氨酸代谢呈正相关，提示Bacillus、泛酸与L-缬氨酸间存在营养代谢互作关系。

3.6. Adding L-Valine to the Diet Promoted the Growth and Development of YS Silkworms

在M20人工饲料中添加1%(w/w) L-缬氨酸饲喂YS五龄幼虫，YS-1%组五龄第3天体重(1.88 ± 0.01 g)、五龄前期摄食量及2–4 d饲料利用率(20.24 ± 0.99%)均显著高于YS对照组；其全茧重(1.10 ± 0.04 g)与茧壳重(0.21 ± 0.05 g)为最高。说明外源L-缬氨酸可改善YS家蚕生长、饲料利用及茧质。

3.7. The Addition of Exogenous Bacillus Promoted the Growth and Development of Silkworms Reared on an Artificial Diet

五龄起蚕开始在饲料中外源添加Bacillus velezensis C4-5、B. subtilis C17或B. rugosus WP-5(10⁷CFU mL^?1)饲喂YS，各处理组五龄第3天体重及结茧后茧层率均有不同程度提升，其中C4-5组增重最明显(2.38 ± 0.05 g vs CK 1.85 ± 0.04 g)，C17与WP-5对茧层率改善较突出。证实外源Bacillus添加可促进人工饲料饲喂YS家蚕的生长与产茧。

讨论与结论总结

讨论部分指出GS较YS具更高消化酶活性是其生长优势的可能原因；血淋巴中L-缬氨酸等多为GS特征差异物，其参与Val/Leu/Ile合成降解、泛酸与CoA合成、ABC转运及氨酰-tRNA合成等通路，推测L-缬氨酸与家蚕生长发育密切相关；两品种中肠微生物结构存在品种特异性差异，GS中Pseudomonas升高、Lactobacillus降低，过量Lactobacillus可能致中肠pH下降不利于人工饲料消化吸收；Bacillus与L-缬氨酸及泛酸代谢正相关，外源添加验证了其促生长作用。

研究结论为：整合代谢组与16S rRNA测序发现L-缬氨酸是与家蚕生长发育显著相关的关键代谢物，且与中肠Bacillus呈强正相关；外源添加1% L-缬氨酸或特定Bacillus菌株可改善人工饲料饲喂YS家蚕的多项生理指标。家蚕肠道微生物群及其代谢物可能与中肠多类代谢活动及消化酶活性相关联，并参与不同人工饲料适应性家蚕品种的摄食表现、体重及茧质差异的形成机制。