从柳蓝叶甲转录组中鉴定和表征解毒基因

《Insects》：Identification and Characterization of the Detoxification Genes from the Transcriptome of Plagiodera versicolora

　　

柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）（鞘翅目：叶甲科），柳叶甲，是一种食叶害虫，通常发生在杨柳科树木上。然而，关于P. versicolora解毒基因的鉴定和系统发育关系存在空白。在此，研究人员从成虫触角转录组数据中鉴定了四个解毒基因家族（谷胱甘肽S-转移酶：GSTs，UDP-糖基转移酶：UGTs，细胞色素P450单加氧酶：CYPs和羧酸酯酶：COEs）。总共鉴定出146个候选解毒基因，包括22个GSTs、20个UGTs、60个CYPs和44个COEs。研究人员使用定量实时PCR技术探究了12个PvGSTs在P. versicolora中的组织表达模式。结果表明，7个PvGSTs在触角中显著高表达，表明这些PvGSTs可能在降解和/或灭活性信息素和寄主挥发物中发挥重要作用。P. versicolora解毒基因的鉴定和系统发育分析扩展了鞘翅目数据库，并有助于后续对解毒基因功能的深入研究。

柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）是一种以杨柳科树木为食的鞘翅目害虫，其解毒系统在寄主定位、取食及防御有毒化合物中起关键作用。解毒基因家族主要包括谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases, GSTs）、UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases, UGTs）、细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases, CYPs）和羧酸酯酶（Carboxylesterases, COEs），这些基因也属于气味降解酶家族，参与气味分子失活和外源物代谢。然而，目前对柳蓝叶甲解毒基因的鉴定及系统发育关系尚属空白。为此，研究人员从柳蓝叶甲成虫触角转录组中鉴定出四个解毒基因家族，并利用系统发育分析和实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）技术探究其进化关系和组织表达模式。研究共获得146个候选解毒基因，包括22个GSTs、20个UGTs、60个CYPs和44个COEs；进一步分析发现7个GSTs在触角中高表达，提示其可能参与性信息素和寄主挥发物的降解或失活。该研究扩展了鞘翅目昆虫解毒基因数据库，为后续功能研究奠定了基础。该论文发表在《Insects》期刊。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）昆虫样本采集自中国武汉沙湖公园，在实验室条件下（28±1°C，相对湿度70±5%，光周期12h:12h）饲养并收集触角和身体组织。2）利用TRIzol试剂提取总RNA，通过NanoDrop-2000检测浓度，使用HiScript III cDNA合成试剂盒合成互补DNA（cDNA）。3）从已发表的成虫触角转录组数据中鉴定候选解毒基因，通过BLASTX在NCBI数据库验证，利用ORF finder预测开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），SignalP预测信号肽，InterPro预测结构域。4）系统发育分析：选取其他鞘翅目昆虫（如咖啡虎天牛Xylotrechus quadripes、赤拟谷盗Tribolium castaneum等）的解毒基因蛋白序列，使用ClustalX 2.1比对，FastTree v2.1.11在JTT模型下构建最大似然树。5）表达谱分析：选取12个具有完整ORF的PvGSTs，设计特异性引物，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行qRT-PCR，以RPS18为内参基因，采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量，利用ANOVA和Tukey HSD检验显著性。

**3.1. KEGG Pathway Analysis**
研究人员将unigenes注释到6个数据库（NT、NR、Swiss-Prot、GO、KEGG、KOG），其中KEGG代谢通路分为5个分支：细胞过程（1045条unigenes）、环境信息处理（1212条）、遗传信息处理（1369条）、代谢（2004条）和有机系统（1825条）。

**3.2. Identification of GSTs**
基于成虫触角转录组鉴定出22个GSTs（命名为PvGSTs），其中14个具有完整ORF，编码蛋白长度204–263个氨基酸。保守域预测显示10个PvGSTs含有谷胱甘肽（GSH）结合位点，12个含有底物结合位点；2个（GSTe1和GSTe4）仅含底物结合位点，2个（GSTe1和GSTe4）两者均缺失。系统发育分析将22个PvGSTs聚类为8个分支：epsilon（6个）、delta（4个）、sigma（8个）、zeta（1个）、omega（1个）、theta（1个）和未分类（1个）。

**3.3. Identification of UGTs**
鉴定出20个UGTs（命名为PvUGTs），其中9个具有完整ORF，编码蛋白长度503–535个氨基酸。所有全长蛋白在N端含有信号肽，C端含有跨膜结构域，并具有核苷酸结合残基、磷酸结合残基和苷元结合残基，以及两个糖供体结合区域（DBR1和DBR2）和签名基序。系统发育树显示20个PvUGTs分为8个亚家族：UGT50、UGT311/312、UGT319/320/321、UGT324、UGT323/325、UGT347/327/326、UGT328和UGT331；其中UGT319/320/321亚家族最大，包含13个成员，提示可能存在物种特异性串联重复事件。

**3.4. Identification of CYPs**
鉴定出60个CYPs（命名为PvCYPs），其中28个具有完整ORF，编码蛋白长度463–579个氨基酸。系统发育分析显示CYPs分为4个家族：线粒体（Mito）成员（10个）、CYP2（2个）、CYP3（30个）和CYP4（18个）。

**3.5. Identification of COEs**
鉴定出44个COEs（命名为PvCOEs），其中19个具有完整ORF。根据昆虫COEs分类系统，PvCOEs分为3大类5个clades：胞内催化类中，clade A包含26个，clade C包含8个；分泌催化类中，clade E包含4个；神经发育类中，clade L包含5个，clade J包含1个。未发现其他5个clades（D、F、I、K、M）的成员。

**3.6. Expression Profile of GSTs**
通过qRT-PCR检测12个PvGSTs在触角和身体中的表达水平，结果显示：PvGSTs2和PvGSTe4在雌雄触角和身体间无显著差异；PvGSTs3、PvGSTs5和PvGSTe6在身体中高表达，且在雄性身体中更高；PvGSTs4、PvGSTs6、PvGSTo1、PvGSTz1、PvGSTd3、PvGSTu1和PvGSTt1在触角中高表达，且无性别偏好。

讨论部分，研究人员将本研究鉴定的解毒基因数量与其他昆虫进行比较：GSTs数量（22个）与家蚕（23个）相当，少于马铃薯甲虫（30个）和赤拟谷盗（41个），多于长红锥蝽（14个）和蜜蜂（10个）；UGTs数量（20个）与华北大黑鳃金龟（20个）相似，少于咖啡虎天牛（30个），多于亚洲玉米螟（13个）；CYPs数量（60个）少于星斑天牛（64个）、小蜜蜂（116个）和松树大小蠹（85个），提示可能鉴定不完全；COEs数量（44个）与咖啡虎天牛相同，少于黄带脊虎天牛（64个）和马铃薯甲虫（72个），多于黑腹果蝇（35个）。此外，在UGTs系统发育中，PvUGTs的UGT319/320/321亚家族出现物种特异性扩张（13个成员），与其他鞘翅目中特定亚家族扩张（如咖啡虎天牛的UGT352、星斑天牛的UGT352、赤拟谷盗的UGT324等）类似，可能源于串联重复事件。触角高表达的GSTs（如PvGSTs4、PvGSTd3等）可能作为气味降解酶，通过降解或失活性信息素和寄主挥发物来维持嗅觉系统敏感性，这一推测在玉米象（SzGSTd1）、印度谷螟（PiGSTd1）、家蚕（BmGSTD4）和烟草天蛾（GST-msolf1）等研究中已有类似发现。

研究结论翻译如下：总之，研究人员从柳蓝叶甲成虫触角转录组数据中获得了146个解毒基因，包括22个GSTs、20个UGTs、60个CYPs和44个COEs。表达谱显示，3个PvGSTs在腹部高表达，表明这些PvGSTs可能参与物质代谢；此外，7个PvGSTs在触角中具有高表达水平，提示这些PvGSTs可能参与气味感知。该研究将有助于未来探索柳蓝叶甲的解毒和化学感受机制。