鳄梨(Persea americana)NAC转录因子的全基因组鉴定与特征分析：果实发育过程中的表达分析

《Genes》：Genome-Wide Identification and Characterization of NAC Transcription Factors in Avocado (Persea americana): Expression Analysis During Fruit Development

　　

背景：NAC（NAM、ATAF、CUC）家族是植物特有的最大转录因子（Transcription Factor, TF）家族之一，在果实发育、成熟、种子生活力及逆境应答中起关键作用。然而经济重要园艺作物鳄梨（Persea americana）中NAC基因的系统鉴定尚鲜见报道。方法：研究人员利用BLASTP分析、系统发育重建、表达谱分析及加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）对鳄梨基因组中NAC转录因子（TF）基因进行了全基因组鉴定与系统表征。结果：共鉴定到130个NAC基因（PaNAC），分布于全部12条染色体；系统发育分析将其划分为8个亚族。WGCNA鉴定出43个共表达模块，其中68个PaNAC基因分布于24个与激素信号、细胞壁修饰、次生代谢及脂肪酸β-氧化相关的模块。在48,785个果实发育差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）中，70个PaNAC基因为差异表达，PaNAC003和PaNAC002上调最强，PaNAC023和PaNAC025下调最强；在9488个乙烯（Ethylene）响应DEGs中，PaNAC041受乙烯抑制而被1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene, 1-MCP，乙烯感知竞争性抑制剂）诱导表达，而PaNAC016、PaNAC085和PaNAC086呈相反模式。结论：上述发现为今后PaNAC基因功能研究及其在鳄梨果实发育和采后成熟中的潜在作用提供了基因组与转录组框架。

论文解读：鳄梨(Persea americana)NAC转录因子的全基因组鉴定与特征分析及其在果实发育与采后成熟中的表达模式

研究背景与立项依据

鳄梨（Persea americana）是重要的跃变型(climacteric)果树作物，其果仁中油脂积累发生于挂树成熟期而非采后软化阶段，且采后成熟高度依赖乙烯(Ethylene)信号调控，1-甲基环丙烯(1-Methylcyclopropene, 1-MCP)处理可干扰其成熟进程。NAC转录因子（Transcription Factor, TF；命名源自NAM、ATAF及CUC）是植物特有、含保守N端NAC结构域及可变C端转录调控区的最大基因家族之一，已被证实参与胚胎发生、叶衰老、果实成熟及乙烯生物合成调控。虽然拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄、猕猴桃等物种的NAC家族已有深入研究，且鳄梨中已报道脂肪酸去饱和酶(Fatty Acid Desaturase, FAD)基因家族及生长素响应因子(Auxin Response Factor, ARF)家族的全基因组分析，但鳄梨NAC基因家族的全基因组水平系统性鉴定与果实发育/乙烯响应表达特征至今未见报道。鉴于鳄梨独特的脂质富集果肉质地与成熟生理，阐明PaNAC家族的组成、进化及转录动态对理解其果实发育与采后成熟的转录调控机制具有重要意义。本文发表于《Genes》期刊。

主要技术方法概述

研究人员以哈斯(Hass)鳄梨为材料，采集叶片、雄蕊、雌蕊、种子、树皮、根6种组织及授粉后15个连续果实发育与采后成熟阶段（S1–S12为树上发育期，P1–P3为25℃采后0、4、8天）样品各3次生物学重复；另设采后1-MCP、乙烯利(Ethephon, YXL)及对照处理采样（各6次生物学重复）。采用HMMER基于PF01849与PF02365隐马尔可夫模型联合BLASTP比对117个AtNAC蛋白（E-value ≤ 1×10??，相似度≥30%）鉴定PaNAC基因，经NCBI CD-Search验证NAC结构域。使用MEME进行蛋白基序(Motif)分析，MCScanX进行基因组内/间共线性(Synteny)分析，MAFFT比对后IQ-TREE2构建最大似然(Maximum Likelihood, ML)系统发育树。RNA-seq数据经HISAT2比对、featureCounts定量，DESeq2筛选差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs；|log?FC| ≥ 1.5，Padj < 0.05)。采用WGCNA（软阈值β=14，动态剪切算法）基于15个成熟阶段转录本(TPM)构建共表达网络并做模块–性状关联与功能富集分析。

研究结果

3.1. PaNAC基因具保守基序组成但基因结构多样

研究人员通过HMMER与BLASTP联用从鳄梨基因组鉴定出130个PaNAC基因。蛋白长度106–1159 aa，分子量12–129 kDa，等电点pI 4.10–10.07。与117个拟南芥AtNAC蛋白联合建树将其划分为8个亚族。MEME鉴定出20个保守基序，其中Motif 2、7、6、4、1分别对应NAM亚结构域A–E构成N端DNA结合域，部分成员缺失典型亚结构域可能暗示假基因化或新功能化。同一亚族内旁系同源基因的外显子–内含子结构相对保守，表明亚族内进化约束较强。

3.2. PaNAC基因不均分布於染色体

130个PaNAC基因分布于全部12条染色体(CM1–CM12)。CM6最多(n=22)，其次CM2(n=21)、CM1(n=19)；CM10仅1个，CM8为3个。CM6上存在明显串联重复基因簇（如PaNAC125/119/120/128/121/117/123/126及另一组PaNAC118/122/116/124），提示片段重复与串联复制参与了该家族扩张。

3.3. PaNAC基因的保守共线性

基因组内共线性分析鉴定到11对共线PaNAC基因对(22个基因)，主要位于CM3、CM5、CM7及CM1、CM6。与拟南芥(A. thaliana)种间共线性分析发现35个共线区块含39对共线基因对，涉及25个PaNAC基因；其中PaNAC011与AT3G15170.1(AtCUC1)高度同源，提示其可能具类似CUC1的器官边界建立功能。

3.4. PaNAC基因划分为与AtNAC直系对应的亚族

将130个PaNAC与117个AtNAC蛋白构建ML系统发育树，PaNAC028–PaNAC043与OSNAC7分支聚为一支，PaNAC011–PaNAC021与NAM分支聚为一支，整体呈现与拟南芥NAC亚族清晰的直系同源关系，反映鳄梨NAC家族的功能分化可追溯至双子叶植物共同祖先。

3.5. PaNAC基因表现组织特异性表达及成熟相关共表达模块

组织表达谱显示PaNAC106、PaNAC089在叶高表达，PaNAC027、PaNAC053在雄蕊高表达，PaNAC042、PaNAC058在根高表达。果实发育时序聚类表明部分PaNAC在挂树发育期(S1–S12)高表达（推测参与挂树发育调控），部分在采后成熟期(P1–P3)高表达（参与采后成熟转录重编程）。WGCNA将23052个表达基因划为43个模块，68个PaNAC归入24个模块；功能富集显示这些模块涉及植物激素信号转导（darkolivegreen模块）、脱落酸(Abscisic Acid, ABA)激活信号（tan模块）、茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)介导信号（red模块）、类黄酮及苯丙烷类生物合成（royalblue、darkturquoise模块）、木葡聚糖代谢（orange模块）及脂肪酸β-氧化（turquoise模块，含7个PaNAC），后者契合鳄梨果肉质地高脂特性。发育期比较鉴定48,785个DEGs中含70个差异表达PaNAC，PaNAC003与PaNAC002上调幅度最大，PaNAC023与PaNAC025下调幅度最大。乙烯处理比较鉴定9488个乙烯响应DEGs中含17个上调及25个下调PaNAC；PaNAC041被乙烯利抑制而被1-MCP诱导，提示其为乙烯负调控因子；PaNAC016、PaNAC085、PaNAC086被乙烯利诱导而被1-MCP抑制，提示其为乙烯激活的正向调控因子，可能参与采后成熟启动。

讨论与结论总结

讨论指出鳄梨作为跃变型果实，成熟伴随呼吸跃变与自催化乙烯产生，ACC合酶(ACC Synthase, ACS)在跃变期重新合成是关键。虽其他果实已报道NAC可正向或负向调控ACS/ACO表达影响乙烯合成，鳄梨PaNAC此前未界定。本研究确认130个PaNAC具与其他物种一致的NAC结构域架构，分属与拟南芥对应的8个亚族，组织及发育阶段特异性表达模式筛选出PaNAC003、PaNAC002、PaNAC023、PaNAC025、PaNAC016、PaNAC041、PaNAC085、PaNAC086为高优先级候选基因。DEGs富集分析除共有途径（激素信号、细胞壁修饰、苯丙烷类）外，显著富集脂肪酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成及脂肪酸β-氧化通路，体现鳄梨高脂果肉质地的物种特异性转录重编程特征。

结论（翻译）：本研究呈现了鳄梨(P. americana)NAC转录因子家族的全基因组系统鉴定，提供了整合基因结构、系统发育关系、染色体分布及跨果实发育、采后成熟与激素处理的转录动态的数据库，为后续PaNAC基因功能研究及其在鳄梨品种改良中的潜在应用奠定了基础。