综述：聚羟基丁酸酯高产代谢途径与基因工程策略研究进展

《Processes》：A Review of Metabolic Pathways and Genetic Engineering Strategies for Enhanced Polyhydroxybutyrate Production

　　

可生物降解塑料的生产被认为是应对塑料废弃物与全球污染的最佳替代方案之一。聚羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate, PHB）作为研究最为深入的生物塑料，由于最终成本较高，其在全球工业与市场中的推广仍面临挑战。深入理解该生物聚合物的完整合成过程是解决问题的有效途径。本综述阐述了与PHB生物合成相关的四条主要天然代谢途径，分别涉及糖类代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸从头合成及丁酸途径，同时探讨了乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为核心前体分子的作用。研究人员还针对理化条件优化与理想底物筛选进行了分析，旨在实现兼具经济可行性与环境可持续性的PHB生产。与其他倾向于关注聚羟基烷酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHA）特定方面的综述不同，本工作提供了PHB生物合成的更新且全面的概览。此外，研究人员识别了若干知识空白，并讨论了多种基因工程策略，包括基因过表达、竞争性途径敲除、CRISPR干扰（CRISPRi）技术应用及两阶段发酵，这些策略在优化PHB合成与降低生产成本方面已显示出潜力。

1. 1.
   引言
   人类因合成塑料具备多样化的性能而在各行业中广泛依赖其使用，其优异的物理化学与形态学特性推动了全球范围内的生产与消费，尤其是其耐用性、抗性及易加工性使其成为难以自然降解的材料。然而，塑料的大量使用与处置带来了显著的环境影响与废弃物管理难题，其抗降解性与易丢弃性导致动物死亡、排水系统堵塞引发洪水风险，并产生生物累积毒性效应，助长人畜共患病的传播条件。为解决塑料废弃物问题，需探索替代方案。传统塑料含有化学添加剂，过量生产与废弃会引发环境与生态系统及生物体的负面影响，而现有常规废弃物管理方法在处理持续增加的塑料积累方面存在局限性。近二十年来，用可生物降解材料替代合成塑料受到广泛关注，原因在于回收与焚烧并非长久之计，且焚烧会释放大量二氧化碳。
   可生物降解塑料如聚羟基烷酸酯（PHA）旨在模拟传统合成塑料的关键性能，并在废弃后完全降解且不产生有毒废物。PHA表面层含有磷脂与蛋白质，对物理化学胁迫敏感，易被微生物产生的PHA解聚酶（PhaZ）降解；温度、pH与湿度等环境因素会影响酶活性，从而调节降解速率。PHB作为研究最广泛的PHA类型，可由细菌合成，占菌体干重最高可达90%，在不同环境中均表现出显著的生物降解潜力。为实现微生物合成PHB的商业化并使其与传统聚合物如聚乙烯或聚丙烯竞争，解析其生物合成代谢途径至关重要。本综述重点总结了当前PHB生物合成的四条天然代谢途径及其与基因工程的结合进展，区别于以往仅关注PHA生产特定方面的研究，旨在识别知识空白并为优化合成与降低成本的研究提供方向。
2. 2.
   结构与性质
   聚羟基丁酸酯（PHB）是一种短链生物聚合物，由细菌细胞通过利用天然资源的代谢途径合成，相关研究致力于采用可再生、低成本且可生物降解的原料进行加工。PHA作为羟基烷酸酯的脂肪族聚酯，因与传统合成塑料性质相似而备受关注。PHB于1925年由Maurice Lemoigne发现，是一类由多种细菌属产生的热塑性材料，在适宜条件下可作为能量储备物质，积累量可达菌体干重的80%。研究表明PHA可有效减少二氧化碳排放与化石燃料消耗，但调整其性能并实现成本效益仍具挑战。
   PHA及其衍生物的性质受菌种、培养条件与碳源种类等因素影响，其独特性源于侧链长度与单体组成的差异。PHB即P(3HB)，是一种短链均聚物，因易于生产且可替代聚丙烯（PP）与聚乙烯（HDPE）而被广泛研究。PHA按结构碳原子数分为短链（scl-PHA，3-5个碳）、中链（mcl-PHA，6-14个碳）与长链（lcl-PHA，≥15个碳），结构差异赋予其不同的物理化学性质：scl-PHA结晶度高、刚性强，而mcl-PHA与lcl-PHA柔韧性好、结晶度低。不同单体的共聚可形成P(3HB-co-3HV)、P(3HB-co-4HB)与P(3HB-co-3HHx)等主要共聚物，相较于PHB均聚物，它们结晶度更低、生物降解性更高，并可调节熔融温度，因此在工业领域的应用正不断扩展。
   PHB是由β-羟基丁酸衍生的半结晶线性聚酯，在细胞内呈流体无定形状态。尽管溶剂提取后较脆，但其熔融温度高达约177°C，具备优异的耐热性与抗分解能力，适合工业应用。PHB商业化面临的主要挑战在于碳源、发酵与聚合物加工成本高昂，其中碳源成本约占总成本的45%，因此解析PHB合成代谢途径成为解决成本问题的关键。
3. 3.
   PHB生物合成
   PHB的生物合成最早于1959年在光合细菌Rhodospirillum rubrum中以乙酸盐为碳源被证实，其合成受营养限制与通气条件等多种因素影响。PHB是中性渗透调节碳源与能量储备物质，在碳源供应超过细菌即时消耗需求时合成，并可在饥饿期被调动利用。碳源可来自糖类、脂肪酸及其他化合物，通常在氮、磷、硫、铁或葡萄糖受限的底质中由微生物代谢产生。
   高效构建并整合PHB生产的代谢途径依赖于底物积累与PHB合成活性。目前已在不同微生物中发现约14条PHA相关代谢途径，但仅有4条与PHB生物合成及乙酰-CoA生成密切相关。此外，底物可用性与关键基因过表达对短链生物聚合物（含PHB）的生产至关重要，这些基因编码β-酮酰基-CoA硫解酶（phbA）、乙酰乙酰-CoA还原酶（phbB）与P(3HB)聚合酶（phbC）等关键酶。PHB形成的四条主要天然途径均与诱导乙酰-CoA生成的条件相关，乙酰-CoA是多种生物材料合成的核心前体，因此当前研究聚焦于优化糖与脂肪酸代谢以促进乙酰-CoA转化，从而实现PHB的高效生产。
4. 4.
   乙酰-CoA在PHB生产中的作用
   生物技术推动了微生物活动的认知与应用，其产品在替代石化材料与促进可持续发展方面潜力显著，但因碳源成本高导致市场化进程缓慢。为此，研究人员采用替代碳源与微生物基因工程等策略以降低成本，这对可持续技术进步与PHA工业应用扩展至关重要。
   深入理解微生物细胞代谢途径并开发优化工艺是提升生物产品生产的关键。乙酰-CoA在细胞代谢中处于核心地位，可由葡萄糖、脂肪酸与氨基酸分解代谢产生，除通过三羧酸循环（TCA循环）参与能量生成外，还是萜类、异丙醇、聚酮类与脂肪酸等物质合成的基础分子。乙酰-CoA的可用性对PHB合成尤为关键，其控制着胞内碳通量；代谢工程策略常被用于优化乙酰-CoA供给，以避免代谢失衡影响PHB合成。
   研究人员探索了从不同底物合成乙酰-CoA的途径，包括糖酵解、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、乙酸激酶-磷酸乙酰转移酶与乙酰-CoA合成酶等；在脂肪酸充足时，脂肪酸氧化也可贡献NADH以生成乙酰-CoA。细菌饥饿期时，乙酰-CoA会被导向生成酮体（乙酰乙酸与β-羟基丁酸）作为替代能源；在环境胁迫下，微生物会将乙酰-CoA转向酮体合成。若乙酰-CoA通量失衡，其可能被分流至其他途径，从而降低PHB产量，因此需通过代谢策略严格控制该通量。饥饿期乙酰-CoA生成的β-羟基丁酸经聚合形成PHB，作为细胞燃料储备，但该过程涉及复杂的代谢网络，仍需进一步研究单体形成与聚合的具体机制。
5. 5.
   代谢途径
   微生物可将羧酶体作为储存结构，其中无机型含氧化铁核心，有机型含磷脂或PHA等蛋白类物质。营养限制胁迫下，PHB颗粒在这些内含体中积累，防止过量辅酶A抑制PHB合成酶，同时胁迫将乙酰-CoA导向TCA循环，限制辅酶A生成以避免PhaA受抑。
   PHB是β-羟基丁酸的聚合物，由β-酮硫解酶（PhbA）、乙酰乙酰-CoA还原酶（PhbB）与PHB合酶（PhbC）三步催化合成：细胞呼吸产生的两分子乙酰-CoA经β-酮硫解酶缩合为乙酰乙酰-CoA；随后乙酰乙酰-CoA还原酶以NADPH为辅因子将其还原为(R)-3-羟基丁酰-CoA；最后PHB合酶将其聚合成聚(3-羟基丁酸酯)。该过程每聚合一次释放一分子辅酶A，且需要高浓度的(R)-3-羟基丁酰-CoA。

5.1 代谢途径I

该途径以糖类为底物（如葡萄糖、葡糖酸盐、木糖、蔗糖与果糖），经代谢生成丙酮酸这一乙酰-CoA的关键前体。丙酮酸可通过Entner–Doudoroff（ED）、戊糖磷酸（PP）与Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径生成。EMP途径能量效率更高（产ATP更多），ED途径则有利于PHB合成（产NADPH更多，为乙酰乙酰-CoA还原酶提供必需辅因子）；PP途径在氧化相将NADP⁺还原为NADPH，且优先保障PHB合成而非ATP生成，因此NADPH生成途径是代谢工程提升PHB产量的关键。丙酮酸最终经丙酮酸-甲酸裂解酶转化为乙酰-CoA，两分子乙酰-CoA经β-酮硫解酶缩合为乙酰乙酰-CoA，再经NADPH依赖的还原反应生成(R)-3-羟基丁酰-CoA，进而聚合形成PHB。

5.2 代谢途径II

脂肪酸代谢产物可用于制备醇、烷烃、酮与酯等化学品，在PHA合成中具有重要价值。假单胞菌（Pseudomonas putida）中脂肪酸与PHA生物合成关联密切，该途径主要生成中链PHA（mcl-PHA），但有助于理解碳源与代谢前体对PHA组成的影响，近期研究亦表明乙酸作为碳源可用于PHB生产。

脂肪酸分解代谢依酶系、碳源与微生物种类分为β-氧化循环（将脂肪酸转化为碳源）与从头合成途径（受葡糖酸盐、乙酸盐或乙醇等调控，限产中链PHA）。β-氧化循环可利用乙酸盐等脂肪酸，将其裂解为酰基-CoA，生成(R)-3-羟基酰基-CoA这一PHB合成的主要底物；该过程由酰基-CoA连接酶启动，经酰基-CoA脱氢酶调控以应对细胞胁迫，生成烯酰-CoA后经水合酶作用生成(R)-3-羟基酰基-CoA，再由PHB合酶聚合为PHB。

5.3 代谢途径III

该途径将乙酰-CoA导向丙二酰-CoA，后者是驱动生物聚合物形成的关键分子，源自丙二酸，参与脂肪酸合成并抑制β-氧化。研究发现丙二酰-CoA与短链聚合物（如PHB）合成相关，该过程不严格依赖单一碳源，在大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等不同菌种中存在差异；乙酰-CoA羧化酶（ACC）负责将乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA，fabH与fabD基因参与脂肪酸合成调控。fabH与fabD分别编码将乙酰-CoA转化为乙酰-ACP、丙二酰-CoA转化为丙二酰-ACP的蛋白；丙二酰-ACP经转化生成3-酮酰基-ACP，再由β-酮酰基-ACP还原酶还原为(R)-3-羟基酰基-ACP，最终经3-羟基酰基（ACP到CoA）转移酶生成(R)-3-羟基酰基-CoA，由PHB合酶聚合成PHB。

5.4 代谢途径IV

丁酸在制药、医疗与化工等领域应用广泛，具备替代石化产品的潜力，其厌氧生产常与多种细菌代谢相关。该途径多在葡萄糖受限的补料分批过程中进行，过量葡萄糖会导致细胞渗透脱水；目前其酶促反应仅部分阐明，且丁酸在不适宜条件下对细胞的毒性仍是限制其应用的主要因素。

该途径偏离β-氧化循环，生成S-3-羟基丁酰-CoA：由短链酰基-CoA合成酶启动脂肪酸合成，最终形成丁酰-CoA；2-丁烯酰-CoA的后续转化生成S-3-羟基丁酰-CoA，再经3-羟基酰基-CoA脱氢酶催化，以NAD⁺为氧化剂将羟基氧化为酮基，生成乙酰-CoA这一PHB合成的前体。

1. 6.
   基因工程改良策略
   近年基因工程技术已成功提升PHB生产效率并降低成本，重点在于通过引入高积累与高底物利用效率菌株的基因优化发酵过程。主要策略包括：在非产PHB但底物利用高效的宿主中导入合成基因；在产PHB菌中插入高效底物吸收基因；通过产PHA菌间的基因交换获得特定PHA衍生物或目标性状。
   基因过表达是最常用方法，如贪铜菌（Cupriavidus necator）过表达RpoN与UspA等转录调节因子，可在无环境胁迫时优先分配代谢资源至PHB合成；大肠杆菌过表达编码PHB合成三步反应的phaCAB操纵子，结合乙酰-CoA的高供给可显著提升重组菌株的产量。敲除竞争性代谢途径（如ldhA、poxB、pta等基因编码的途径）可减少乙酰-CoA的分流，结合CRISPRi技术沉默竞争基因，可有效提升乙酰-CoA用于PHB合成的通量；基因重组还可移除竞争基因并将非天然途径导入非产PHA宿主。两阶段发酵技术通过第一阶段扩大生物质、第二阶段以营养限制诱导PHB合成，已在多种野生型与重组菌株中证明高效且通用。
   大肠杆菌因高积累潜力与易提取特性成为优选宿主，贪铜菌则在底物吸收方面表现优异。研究人员通过将真养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha）基因导入假单胞菌（Pseudomonas sp.）提升了以葡糖酸盐与烷酸盐为碳源的积累量；以贪铜菌为宿主表达色杆菌属（Chromobacterium sp.）基因也显示出低成本加工潜力。重组DNA技术可将高PHA储存菌的代谢途径基因克隆并表达于其他微生物，大肠杆菌因无天然合成途径而成为第二大PHA生产者。除细菌外，绿藻与酵母也具备PHA储存能力，已将贪铜菌基因克隆至酿酒酵母中实现PHB表达，其他参与脂肪酸合成的酵母菌种同样具备生产潜力。
2. 7.
   结论与未来展望
   PHB作为石油基塑料的潜在替代品，其高成本是主要障碍。解析代谢途径可优化酶促反应以实现低成本生产，构建细菌代谢途径并结合先进酶表达工具是关键。基因工程通过优化基因组合可提升产量而不显著增加成本，替代碳源的使用也有助于降低成本并促进推广应用。
   石化塑料因稳定长链结构难以降解，带来环境与健康风险；尽管可生物降解塑料已被探索多年，成本问题仍未解决。近期研究聚焦于微生物基因工程以提升PHA储存能力与产量，推动其进入市场。尽管PHA工业应用前景广阔，但全球普及度仍低，主因是传统塑料成本更低。为降成本，PHA与PHB可通过甘蔗、甜菜、香蕉与玉米等替代碳源发酵生产（对应代谢途径I），富含脂肪酸的碳源则对应途径II；重组DNA技术也在探索更多碳源的应用。贪铜菌在PHA与PHB储存方面表现最优，绿藻与部分野生酵母菌也具潜力。
   本综述展示了PHB生物合成的多项进展，但仍存在待填补的知识空白：碳源成本占总成本约45%，开发低成本替代底物至关重要；途径IV（丁酸途径）的酶促反应机制尚未完全阐明，丁酸细胞毒性的调控机制需进一步研究；目前仅4条PHB相关天然代谢途径被详细描述，探索其他潜在途径将是未来研究的重要方向。综合应用多种基因工程技术并优化发酵工艺，有望推动PHB的大规模生产，助力环境可持续发展。