类骨小梁支架通过流体剪切应力诱导CAV1–HIF-1α轴介导的代谢重编程调控骨向分化

《Research》：Trabecular-Like Scaffold Dictates Osteogenesis via Fluid Shear Stress-Induced Metabolic Reprogramming through the CAV1–HIF-1α Axis

　　

骨支架的结构设计决定了局部流体力学微环境，但此类物理信号如何通过编程干细胞代谢进而驱动骨向分化尚不清楚。本研究构建了具有可调孔隙率的Voronoi基类骨小梁支架，在保持拓扑结构一致的前提下调节流体剪切应力(fluid shear stress, FSS)。计算流体动力学(computational fluid dynamics, CFD)分析证实较低孔隙率架构产生较高FSS，可用于可控研究机械–代谢偶联。动态培养条件下，高FSS支架上的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在体外增强骨向分化，并在体内促进骨再生。整合转录组、蛋白质组和代谢组分析鉴定小窝蛋白-1(caveolin-1, CAV1)为显著的FSS响应膜调节因子。机制上，CAV1增强磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)–AKT信号，稳定缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)，诱导糖酵解偏移以满足骨向分化所需的能量和生物合成需求。研究人员通过药理学抑制PI3K、HIF-1α或糖酵解消除了FSS驱动的骨向响应，验证了以CAV1为中心的机械–代谢轴。这些发现确立了支架微结构与骨向分化代谢调控的直接联系，并为机械指导性骨修复材料的设计提供原理。

论文解读：类骨小梁支架通过流体剪切应力诱导CAV1–HIF-1α轴介导的代谢重编程调控骨向分化

研究背景与意义

大段骨缺损修复是临床重大挑战，仿生结构骨支架是最重要的骨填充与再生策略之一。传统三维(three-dimensional, 3D)打印支架设计关注与天然骨的力学匹配及宏观孔隙连通性，但忽视了孔隙架构对内部流体力学微环境——特别是骨陷窝–小管系统中存在的流体剪切应力(fluid shear stress, FSS)——的精确调控作用。FSS是调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)骨向分化的关键物理刺激，然而现有支架难以在不变更整体拓扑骨架的前提下单独调节孔隙率以隔离FSS的作用，且FSS被BMSCs感受并转化为代谢重编程(即早期骨向分化依赖的有氧糖酵解偏移)的分子机制尚未阐明。该研究发表于《Research》，研究人员利用Voronoi图算法构建仿生类骨小梁氧化锆(zirconia)陶瓷支架，在保持拓扑一致时精确调节孔隙率改变FSS幅值，结合多组学、基因敲减及药理学干预，揭示支架微架构经CAV1(小窝蛋白-1, caveolin-1)–PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶, phosphatidylinositol 3-kinase)–AKT/HIF-1α(缺氧诱导因子-1α, hypoxia-inducible factor-1α)轴诱导糖酵解重编程从而促进骨再生的跨尺度机械–代谢偶联机制，为下一代功能型骨支架设计提供理论依据。

主要关键技术方法

研究人员采用Voronoi图结合概率球算法设计孔隙率分别为约55%(V50)、65%(V60)、75%(V70)的类骨小梁支架，以喷墨式材料挤出3D打印(material jetting-based 3D printing)制备氧化锆陶瓷支架并烧结；通过扫描电镜能谱(environmental scanning electron microscopy coupled with energy-dispersive spectroscopy, ESEM-EDS)、准静态压缩及有限元分析(finite element analysis, FEA)表征微观结构与力学性能；利用CFD(commercial COMSOL Multiphysics)模拟流速场与FSS分布；原代小鼠BMSCs及人BMSCs(hBMSCs)接种于支架，在轨道摇床(orbital shaker)施加双向振荡FSS进行动态3D培养；通过活死染色、CCK-8、Annexin V/PI、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)及茜素红S(Alizarin Red S)染色评估细胞活性与骨向分化；整合RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)、非标记定量蛋白质组(label-free quantitative proteomics)及非靶向代谢组(untargeted metabolomics)分析差异表达基因(DEGs)、差异表达蛋白(DEPs)及代谢物，并进行基因本体论(Gene Ontology, GO)与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集、基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)；以Seahorse XF糖酵解压力测试检测细胞外酸化率(extracellular acidification rate, ECAR)；进行稳定同位素示踪(stable isotope-resolved metabolic tracing, ¹³C₆-glucose)量化糖酵解通量；构建Cav1慢病毒shRNA敲低及使用LY294002(PI3K抑制剂)、YC-1(HIF-1α抑制剂)、2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose, 2-DG, 糖酵解抑制剂)药理学阻断验证信号轴；建立新西兰兔股骨髁临界尺寸骨缺损(critical-sized defect, CSD, Φ5 mm)模型植入支架，12周后micro-CT及硬组织不脱钙切片Goldner三色/HE染色评估体内成骨。

研究结果

Mechanical and permeability characteristics（力学与渗透特性）

通过ESEM-EDS确认V50、V60、V70支架忠实复现类骨小梁不规则互连孔网，孔隙率增大孔径递增。准静态压缩与FEA显示随孔隙率升高屈服强度与弹性模量下降，符合Gibson–Ashby多孔材料模型。CFD模拟表明V50渗透率(2.07×10^?9m²)接近天然骨，较低孔隙率产生更高FSS(V50最大FSS≈1.14 Pa，V60≈0.65 Pa，V70≈0.53 Pa)及更不均一的流场剪切应力分布，证明可通过Voronoi架构单独调控FSS。

Voronoi scaffolds with low porosity provide a favorable microenvironment for BMSC survival and osteogenic differentiation under dynamic FSS（低孔隙率Voronoi支架在动态FSS下为BMSCs存活与骨向分化提供有利微环境）

相同动态FSS刺激下，V50组BMSCs活细胞比例最高、接种效率三组无差异、增殖更强、凋亡率最低。Western blot与qPCR显示V50组骨向蛋白(RUNX2、COL1A1、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)、ALP)及基因(Runx2、Col1a1、Ocn)表达最强；ALP与Alizarin Red S染色证实V50早期ALP活性及21天矿化结节沉积最高，表明低孔隙率高FSS支架最有利于BMSCs存活与骨向分化。

Transcriptomic and proteomic profiling reveals ECM remodeling and suppressed oxidative phosphorylation in BMSCs under HFSS（转录组与蛋白质组学揭示HFSS下BMSCs发生ECM重塑与氧化磷酸化抑制）

HFSS组vs静态对照组RNA-seq与蛋白质组学显示差异基因与蛋白显著富集于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组织、细胞黏附、HIF-1信号及PI3K–AKT通路；氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)相关条目呈负富集(GSEA)，提示HFSS同时促进ECM–黏附机械感知并抑制线粒体呼吸，暗示向糖酵解偏移。

Integrated multi-omics and in vitro validation identify a CAV1-centered reprogramming under HFSS（整合多组学与体外验证鉴定HFSS下以CAV1为中心的重编程）

转录–蛋白共上调靶标富集于糖酵解、HIF-1及PI3K–AKT通路，Cav1、Pfkl、Ldha、Hk2、Slc2a1同步上调。V50组细胞铺展与肌动蛋白应力纤维更明显；Seahorse示V50组ECAR、糖酵解率、糖酵解储备及糖酵解能力最高；Western blot显示V50组CAV1、HIF1A、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)蛋白最高且PI3K–AKT磷酸化最强；免疫荧光CAV1在V50表达最强；qPCR示V50组Hif1a、Ldha、Slc2a1、Cav1 mRNA最高；¹³C₆-葡萄糖示踪显示V50组多个糖酵解中间体同位素同位数(isotopologue fractions)升高，证实真实糖酵解通量增加。人BMSCs得到一致趋势，说明该机械–代谢响应在物种间保守。

Cav1 knockdown attenuates HFSS-induced glycolytic activation and osteogenic differentiation in BMSCs（Cav1敲低削弱HFSS诱导的糖酵解激活与骨向分化）

shRNA敲低Cav1后，HFSS不再引起LDHA、HIF1A、GLUT1上调及ECAR升高，糖酵解与骨向基因表达增幅消失；ALP及矿化结节形成受抑。ITGA3(整合素α3, integrin subunit alpha 3)随HFSS上调且受Cav1部分调控，提示Cav1为支架调控机械转导上游介质，整合素相关黏附信号可能参与下游或平行响应。

Pharmacological perturbation validates a CAV1-centered PI3K–HIF-1–glycolytic axis under HFSS（药理学扰动验证HFSS下以CAV1为中心的PI3K–HIF-1–糖酵解轴）

Cav1敲低消除HFSS对PI3K–AKT磷酸化的激活。LY294002抑制PI3K降低HIF1A、GLUT1、COL1A1及糖酵解指标，取消HFSS诱导的ECAR升高。YC-1降解HIF-1α下调LDHA、GLUT1、COL1A1并抑制ECAR升高。2-DG抑制糖酵解取消HFSS对COL1A1、RUNX2、OPN的上调。证实信号级联为FSS→CAV1↑→PI3K–AKT磷酸化↑→HIF-1α稳定↑→糖酵解重编程↑→骨向分化↑。

In vivo bone defect repair with Voronoi-based trabecular-like scaffolds（基于Voronoi类骨小梁支架的体内骨缺损修复）

兔股骨髁缺损植入12周后，Micro-CT显示V50组新生骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)=5.63±0.23%、骨小梁数(trabecular number, Tb.N)与厚度(trabecular thickness, Tb.Th)最高、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)最低；Goldner三色与HE染色示V50组内新生骨组织最丰富成熟，证实低孔隙率高FSS支架在体内更有效促进骨再生。

讨论与结论总结

讨论指出Voronoi架构可在保持拓扑不变时单独调节孔隙率以改变FSS，克服了传统支架多参数耦合变化的缺陷。多组学发现FSS最显著上调膜微域蛋白CAV1，其作为机械感受器聚集并增强PI3K–AKT信号，稳定HIF-1α，驱动糖酵解重编程供给骨向分化所需ATP与生物合成前体。抑制任一节点( CAV1、PI3K、HIF-1α或糖酵解)均阻断FSS促骨向效应。V50产生的FSS落于生理性最佳窗口(0.5–3.0 Pa)，在体内可将生理灌流转换为促骨向微FSS。研究局限含体内FSS分布未直接测定、氧化锆硬组织切片限制原位信号分子检测及CAV1与YAP/TAZ等其他通路交互待探明。结论：Voronoi类骨小梁支架产生的FSS经CAV1依赖的PI3K–AKT/HIF-1α信号通路驱动糖酵解重编程从而支持BMSCs骨向分化；支架几何形貌是细胞代谢的主动调节器，该发现为集成结构优化与功能兼容性的骨组织工程支架设计提供依据。