《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：Putative Imprinting Control Regions with Aberrant Blood-Based DNA Methylation are Associated with Hepatocellular Carcinoma Risk
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摘要
引言 在血液中测量的位点特异性5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）水平可作为不可及组织中表观遗传改变的合适替代标志物，并与肝细胞癌（HCC）风险相关。然而，由于既往研究基因组覆盖率低且许多CpG位点甲基化具有组织特异性特征，研究结果的可
摘要
引言 在血液中测量的位点特异性5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）水平可作为不可及组织中表观遗传改变的合适替代标志物，并与肝细胞癌（HCC）风险相关。然而，由于既往研究基因组覆盖率低且许多CpG位点甲基化具有组织特异性特征，研究结果的可重复性受到限制。一个例外是印记控制区（ICRs），这些区域利用稳定且早期发生的甲基化来调节跨体细胞组织的单等位基因表达，表明在血液中检测到的ICRs异常甲基化可能与肝脏疾病相关。目的 利用原发性HCC样本，研究人员旨在识别与HCC相关的具有异常DNA甲基化的假性ICRs，为开发基于血液的风险分层panel以用于早期检测和临床分诊提供依据。参与者与方法 对10例原发性HCC病例和51例对照的白细胞来源DNA进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），以识别差异甲基化。另一个独立比较（29例原发性HCC病例和36例对照）使用新型人类印记组甲基化芯片（Human Imprintome Methylation Array）验证白细胞中测量的差异甲基化。结果 通过WGBS，研究人员识别出1,519个与HCC相关的差异甲基化区域（DMRs）（FDR p < 0.05），这些区域映射到81个假性ICRs，其中大多数先前未与HCC相关联。与已发表研究的比较进一步确定了16个先前与HCC或癌前慢性肝病状态相关的假性ICRs，总计97个位点。使用人类印记组甲基化芯片进行验证，复制了其中46个（57%）区域（FDR p < 0.05）。最近基因富集于与肝脏疾病相关的通路，包括肝脏增生、肝炎、脂肪变性和HCC。结论 研究人员全面的基因组分析识别出血液中与HCC相关的假性ICRs异常甲基化。这些发现支持以下假设：ICRs在组织中表现出相对稳定的甲基化，值得作为早期血液HCC生物标志物进行进一步研究。
关键词：DNA甲基化；表观遗传标志物；风险分层；表观遗传分析
论文解读
**研究背景**
肝细胞癌（HCC）已成为美国第五大癌症相关死因，5年生存率仅约22%，主要原因是多数病例在晚期才被诊断，此时治疗选择有限。HCC几乎仅在慢性肝病（CLD）背景下发生，常经历漫长的无症状期后进展为肝硬化。目前基于超声和血清甲胎蛋白（AFP）的筛查策略敏感性和特异性不足，且依从性差。多组学方法如蛋白组学、多基因风险评分（PRS）及复合模型（如GALAD评分、Oncoguard? Liver检测）虽提升了诊断准确性，但多依赖肿瘤衍生信号，难以用于早期风险分层。DNA甲基化变化是肿瘤发生中最早的表观遗传改变之一，并在血液中可测量，但大多数CpG位点的甲基化具有组织特异性，限制了跨组织应用。印记控制区（ICRs）因在配子及植入前胚胎中建立甲基化、抵抗受精后表观重编程、并终身维持于所有体细胞组织，成为独特的候选标志物。既往研究仅涉及少数ICRs（如H19、IGF2、MEG3等），但人类约有1,488个假性ICRs，其中大部分在HCC中的状态未知。因此，需要系统鉴定血液中可检测的HCC相关ICR甲基化异常，以开发早期风险分层工具。该研究发表在《Journal of Hepatocellular Carcinoma》。
**主要技术方法**
研究人员采用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）对来自北卡罗来纳大学教堂山分校Lineberger综合癌症中心的10例原发性HCC病例（接受切除手术）和杜克健康中心的51例健康对照的白细胞DNA进行差异甲基化区域（DMRs）鉴定。随后，通过对45篇已发表文献的系统检索，整合与HCC或癌前肝病（如肝硬化、代谢功能障碍相关脂肪性肝病MASLD、病毒性肝炎）相关的甲基化数据。将这些DMRs与Jima等（2022）报道的1,488个假性ICRs及Akbari等（2022）鉴定的143个候选ICRs进行重叠分析。最后，使用定制的人类印记组甲基化芯片（Human Imprintome Methylation Array，覆盖1,088个假性ICR的CpG位点）在另一个独立队列（29例HCC病例和36例健康对照，来自北卡罗来纳州癌症登记处和杜克癌症研究所）中进行验证。
**研究结果**
**WGBS鉴定外周血白细胞中与HCC相关的DMRs**
通过WGBS分析10例HCC病例和51例对照的白细胞DNA，研究人员识别出1,519个与HCC显著相关的DMRs（FDR q值范围0–0.000486），其中73%（1,103个）表现为低甲基化，27%（416个）表现为高甲基化。这些DMRs中的17.2%在肝组织中富集H3K4me3（活性启动子标记），16.0%富集H3K27ac（活性增强子标记），表明其位于推定调控元件。通路富集分析（IPA）显示，最近基因显著富集于肝脏增生/过度增殖、肝炎、HCC、肝脏脂肪变性等肝毒性通路，以及蛋白激酶A信号、肝纤维化信号、3-磷酸肌醇生物合成等经典通路。
**确定HCC相关假性ICRs的综合列表**
将1,519个血液DMRs与1,488个假性ICRs和143个候选ICRs重叠，得到81个HCC相关假性ICRs。进一步整合45篇文献中的3,275个肝病相关DMRs/CpG位点，额外鉴定出16个与已报道HCC或癌前状态相关的假性ICRs。最终共获得97个HCC相关假性ICRs（92个唯一印记区），其中21个位于已知印记域（如IGF2R|AIRN、MEST|MESTIT1、H19、KCNQ1|KCNQ1OT1、MEG3|DLK1、GRB10、PEG10等）。IPA分析显示这些区域附近基因富集于PTEN信号、IGF-1信号、生长激素信号等HCC风险相关通路。
**在外部HCC病例-对照研究中复制假性ICRs**
使用人类印记组甲基化芯片在独立样本（29例HCC、36例对照）中验证。经质量控制后，70个ICR位点（含1,049个CpG位点）纳入分析。在ICR水平，14个ICR在FDR校正后显著差异甲基化，涉及基因包括LINC02774、RPN1、MCHR2、GRB10、PEG10、MEST、KCNQ1、MEG3、ZNF597、KCNJ18、ZNF331、BLCAP、ELK1和CMC4，其中9个为已知印记基因。在CpG位点水平，46个ICR至少有一个CpG位点显著差异甲基化。代表性ICR（如GRB10、ELK1、BLCAP|NNAT、NAP1L6P）均显示HCC病例中低甲基化模式。
**讨论与结论**
该研究通过全面的基因组分析，在血液中鉴定出97个与HCC相关的假性ICRs异常甲基化，其中大部分为首次报道。鉴于ICRs在组织和年龄间甲基化稳定，这些标志物适用于非侵入性风险分层。通路分析支持这些区域参与生长因子信号、代谢调控和纤维化进程——HCC核心生物学过程。尽管样本量较小，但事后功效分析显示WGBS和验证实验分别有72%和73%的统计功效。研究结论指出：“研究人员实现了一个关键步骤，关键发现为97个假性ICRs在HCC患者和健康个体的血液DNA中表现出差异甲基化。当在更大前瞻性研究中得到复制后，这些标志物可被开发成用于任何场景（包括初级保健）的早期检测生物标志物panel。”
