HnRNPA2B1通过Irgm1的可变剪接调节巨噬细胞中的抗分枝杆菌免疫应答

《Infection and Immunity》：HnRNPA2B1 tunes antimycobacterial immune responses in macrophages through alternative splicing of Irgm1

　　

活动性结核病的发生和发展是由Mtb（结核分枝杆菌）毒力与宿主防御之间微妙平衡的破坏所导致的。由于可变剪接（AS，一种从单个基因生成不同mRNA的过程）能够动态调节细胞中蛋白质表达的功能输出，因此它可能在维持平衡的Mtb-巨噬细胞宿主-病原体界面中发挥关键作用。为了深入了解可变剪接如何塑造抗分枝杆菌免疫应答，研究人员使用了RNA测序（RNA-seq）和剪接感知计算流程，对Mtb感染的骨髓来源鼠巨噬细胞中的可变剪接进行了定量分析。研究人员发现，在Mtb感染后8小时，约5%表达的巨噬细胞基因表现出一个或多个剪接变化，这凸显了可变剪接是巨噬细胞对Mtb应答中的一个关键调控节点。研究人员接着试图识别在Mtb感染期间对塑造巨噬细胞转录组起重要作用的RNA结合蛋白。研究人员发现，剪接因子异质核核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）在应答Mtb时促进了炎症基因的早期诱导，同时抑制了几种I型干扰素刺激基因。hnRNPA2B1还在Mtb感染期间控制了许多基因的可变剪接，包括Irgm1，一种关键的免疫相关GTP酶（immunity-related GTPase）。Irgm1长亚型（Irgm1-long）与短亚型（Irgm1-short）之间的平衡在不同炎症信号的刺激下受到差异调节，而过表达Irgm1-short的巨噬细胞在自噬体靶向、溶酶体稳态以及限制Mtb复制方面存在缺陷。这些数据凸显了AS在塑造巨噬细胞转录组中的关键作用，并指出hnRNPA2B1是细胞内在应答Mtb中的一种新型限制因子。

**论文解读：hnRNPA2B1通过调节Irgm1可变剪接影响巨噬细胞抗分枝杆菌免疫**

**研究背景与问题**

结核病（tuberculosis）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起，其活动性感染的发生与进展取决于Mtb毒力与宿主防御之间微妙平衡的破坏。巨噬细胞作为Mtb的主要复制生态位，在感知病原体后迅速重编程其转录组以启动抗菌防御。除了转录激活，转录后调控步骤，尤其是可变剪接（alternative splicing, AS），在塑造先天免疫环境中日益受到重视。AS通过从单个基因生成不同mRNA，能够独立于转录活性扩展蛋白质组多样性。然而，在Mtb感染过程中，AS如何影响巨噬细胞的抗分枝杆菌免疫应答尚不完全清楚。尽管已有研究表明Mtb感染可在人巨噬细胞中引发数百个AS事件，但调控这些事件的RNA结合蛋白（特别是hnRNP家族成员）在抗Mtb免疫中的作用仍未被深入探索。特别是，hnRNPA2B1（一种A/B家族hnRNP成员）在免疫中的角色研究较少，尽管其在神经系统发育和癌症中有已知功能，但在感染背景下其作用尚待阐明。因此，本研究旨在揭示hnRNPA2B1如何通过调控AS影响巨噬细胞对Mtb的免疫应答。

**研究内容与结论**

研究人员利用条件性敲除小鼠（LysM-cre/cre; hnRNPA2B1^fl/fl）来源的骨髓巨噬细胞（BMDMs），结合RNA测序（RNA-seq）和剪接感知计算流程（MAJIQ-VOILA），系统分析了Mtb感染诱导的AS事件。研究发现，Mtb感染后8小时，约5%的巨噬细胞表达基因发生显著AS变化，以外显子跳跃（ES, 40.2%）和内含子保留（IR, 38.0%）为主。功能富集分析显示这些AS基因主要参与免疫相关通路，如对微生物的应答、髓系白细胞分化和AIM2炎症小体组装调控。进一步，通过比较野生型（WT）和hnRNPA2B1敲除（KO）巨噬细胞的转录组，研究人员发现hnRNPA2B1在Mtb感染中促进炎症基因（如TNF信号、炎症反应）的早期诱导，并抑制I型干扰素刺激基因的表达。重要的是，hnRNPA2B1调控了150个蛋白编码基因的AS，其中包括Irgm1——一种关键的免疫相关GTP酶（immunity-related GTPase）。Irgm1通过外显子2的包含与否产生长亚型（Irgm1-long）和短亚型（Irgm1-short）。hnRNPA2B1倾向于促进外显子2跳跃，从而生成Irgm1-short。功能实验表明，过表达Irgm1-long的巨噬细胞能更有效地限制Mtb复制，而过表达Irgm1-short的细胞则表现出Mtb复制增加，并伴有自噬体靶向缺陷、溶酶体酸化减少及细菌-溶酶体融合障碍。此外，不同免疫刺激（Mtb感染、IFN-γ、IFN-β、TLR激动剂等）可差异调节Irgm1亚型比例，其中IFN-γ显著促进Irgm1-long生成，而Mtb的ESX-1分泌系统对诱导Irgm1-long至关重要。这些发现将hnRNPA2B1确立为一种新型细胞内在抗Mtb限制因子，并揭示了AS在调控抗分枝杆菌免疫中的关键作用。该论文发表在《Infection and Immunity》。

**主要关键技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法（样本来源：C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDMs及永生化的iBMDMs）：1）利用LysM-cre/cre与hnRNPA2B1^fl/fl小鼠构建髓系条件性敲除模型；2）使用RNA-seq结合MAJIQ-VOILA框架进行全局AS分析，并采用DESeq2分析差异表达；3）通过半定量RT-PCR和RT-qPCR验证AS事件及基因表达；4）利用慢病毒构建稳定过表达Irgm1亚型的细胞系；5）通过免疫荧光显微镜（anti-FLAG、LC3、LAMP1）评估自噬体标志物及溶酶体共定位；6）采用活细胞成像（LysoTracker）监测溶酶体酸化与细菌-溶酶体融合；7）利用Mtb-lux ABCDE和CFU计数评估细菌复制；8）使用特异激动剂（PAM3CSK4、ISD、LPS）和细胞因子（TNF-α、IFN-β、IFN-γ）进行免疫刺激。

**研究结果**

**Mtb诱导巨噬细胞感染中功能多样性基因的可变剪接**
对Mtb感染8小时的WT BMDMs进行RNA-seq分析，发现约5%表达基因发生显著AS（dPSI>0.15，概率>0.9），以外显子跳跃（ES, 40.2%）和内含子保留（IR, 38.0%）为主。这些AS基因大多不伴有差异表达，提示AS作为一种独立于转录的调控方式。功能富集分析显示，AS基因主要富集于免疫相关通路（如对微生物的应答、髓系白细胞分化）及基础细胞功能通路。代表性免疫基因如Ikbke、Tank、Ifi203等均观察到Mtb调控的外显子跳跃。

**剪接因子hnRNPA2B1在Mtb感染中调节炎症和I型干扰素基因的表达**
与WT相比，hnRNPA2B1 KO BMDMs在Mtb感染8小时后表现出78个基因上调和135个基因下调。基因集富集分析（GSEA）表明KO细胞中炎症通路（TNF信号、炎症应答、补体）广泛抑制，而细胞周期和干扰素α应答通路上调。RT-qPCR验证了这些差异在感染早期（4-8小时）明显，但24小时后消失，提示hnRNPA2B1在早期平衡炎症与干扰素应答中起作用。此外，hnRNPA2B1 KO BMDMs中Mtb复制显著增加，表明hnRNPA2B1是一种抗分枝杆菌限制因子。

**剪接因子hnRNPA2B1在Mtb感染中控制基因的可变剪接**
对比WT与hnRNPA2B1 KO BMDMs在Mtb感染8小时的AS变化，鉴定出150个A2B1依赖性AS基因，其中144个无表达变化。富集分析显示这些基因参与炎症小体调控、PRR信号和自噬体成熟等免疫通路。在57个与Mtb诱导AS重叠的基因中，多数为外显子包含事件，符合hnRNPA2B1促进外显子跳跃的已知功能。代表性基因包括Ap2m1、Ncoa4和Nedd4l，这些均与自噬或细菌感染相关。

**Irgm1具有两个亚型，在巨噬细胞免疫激活时受到差异调节**
hnRNPA2B1依赖性AS基因中，Irgm1因其在自噬和抗分枝杆菌免疫中的已知作用而成为关注焦点。Irgm1长亚型（含外显子2编码的16氨基酸N端延伸）和短亚型（缺失该区域）在Mtb感染中受到hnRNPA2B1调控：KO细胞中Irgm1-long比例增加。过表达hnRNPA2B1则促进Irgm1-short生成。亚细胞定位预测和免疫荧光实验表明，Irgm1-long更倾向于定位于溶酶体相关囊泡，而Irgm1-short则富集于质膜和胞质结构。

**过表达Irgm1-short抑制巨噬细胞限制Mtb复制**
在iBMDMs中稳定过表达Irgm1-long或Irgm1-short后，用Mtb-lux感染。Irgm1-long过表达细胞中细菌负荷显著降低，而Irgm1-short过表达细胞中细菌负荷升高，且细胞死亡无明显差异。免疫荧光显示，Irgm1-long细胞中LC3⁺ Mtb菌体比例更高，而Irgm1-short细胞中LC3招募减少且LAMP1与Mtb共定位降低。活细胞成像表明，Irgm1-short细胞中LysoTracker荧光明显示弱，且与mCherry-E. coli的共定位减少，提示溶酶体酸化和细菌-溶酶体融合受损。

**病原体来源和炎症刺激差异调节Irgm1 AS**
使用不同免疫刺激处理BMDMs：Mtb（WT vs ΔESX-1）、ISD（cGAS激动剂）、PAM3CSK4（TLR1/2/6激动剂）、LPS（TLR4）、TNF-α、IFN-β和IFN-γ。结果显示，Mtb感染和IFN-γ处理显著促进Irgm1-long生成，而ΔESX-1 Mtb、ISD、PAM3CSK4、LPS、TNF-α和IFN-β则产生更平衡的亚型比例。此外，在Mtb感染中阻断IFNAR信号（抗IFNAR抗体）可进一步促进Irgm1-long生成，表明I型干扰素信号负调控Irgm1-long的产生。

**讨论与结论**

本研究揭示了hnRNPA2B1通过调控Irgm1的可变剪接，在巨噬细胞抗Mtb免疫中发挥关键作用。Irgm1-long与Irgm1-short在功能上具有拮抗作用：前者支持自噬体形成和溶酶体融合，有效限制Mtb复制；后者则损害这些过程，创造许可Mtb复制的细胞内环境。不同免疫刺激通过可能影响hnRNPA2B1翻译后修饰（如磷酸化）的信号通路差异调控Irgm1亚型比例，其中IFN-γ作为强效抗菌细胞因子，特异性地促进保护性Irgm1-long生成。研究结论指出：“这些数据凸显了AS在塑造巨噬细胞转录组中的关键作用，并指出hnRNPA2B1是细胞内在应答Mtb中的一种新型限制因子。” 尽管hnRNPA2B1 KO导致Irgm1-long比例升高，但KO细胞却呈现Mtb易感表型，提示其他A2B1调控的AS事件或非剪接功能（如miRNA生物发生、m⁶A修饰）可能是易感性的主要原因，这为未来研究指明了方向。