微型被动泵自动试剂分配系统的开发

《Actuators》：Development of an Automatic Reagent Dispensing System for Micro Passive Pumps

　　

表面张力泵（surface tension pump）作为一种被动泵送（passive pumping）方法，即使在微重力条件下，也能够在微通道中实现无需外部设备或管路的温和低流速液体输运。然而，由于其依赖于小体积液滴特有的物理现象，因此在大液量和长期运行场景中的适用性受到限制。为克服这一局限，研究人员开发了一种自动试剂分配系统，用于在微流控器件中对入口储液池实施间歇性补充。该系统实现了较高的位置重复性，最大误差低于781 μm，足以满足本研究所用入口孔的操作需求。初步流量表征结果表明，可通过调节分配液滴体积来改变流动行为。研究人员进一步通过一项18 h自动化细胞培养实验对系统进行了评估，结果显示，其细胞保留性能与手动补充培养基所得结果相当。这些结果表明，采用自动化间歇补液可行，可用于延长被动泵送系统的运行时间。

本文发表于《Actuators》，围绕微流控（microfluidics）系统中被动泵送（passive pumping）长期运行受限这一关键问题，提出并验证了一种面向表面张力泵（surface tension pump）的自动试剂分配方案。微流控器件能够利用微观空间中的特殊流体现象，在药物制备、细胞培养以及器官芯片等领域具有重要应用潜力，尤其适用于模拟生物体内血管、组织间隙和细胞周围缓慢流动的液体环境。然而，传统注射泵和蠕动泵在低流速条件下存在明显不足。注射泵易受到齿轮回差、振动、垫圈钉扎以及硅胶管膨胀和形变等因素影响，导致压力波动显著，难以长时间维持稳定低流速；蠕动泵同样依赖可变形硅胶管，不仅低流速稳定性有限，还可能因管路摩擦带来泄漏和颗粒污染风险。此外，这类机械泵在与微通道连接时往往需要复杂装配，增加了人为误差和污染的可能性。因此，开发无需复杂外部装置、又可稳定支持微流控长期运行的供液策略具有明确必要性。

被动泵因利用重力、毛细力、表面张力及气体扩散等环境驱动力驱动液体，而被认为是解决上述问题的重要方向。特别是表面张力泵可在无需昂贵设备和外接管路的条件下，于微通道中形成温和且相对稳定的流动，并且受重力影响较小，适合微环境操作。但其局限在于依赖微小液滴所产生的拉普拉斯压（Laplace pressure），当需要更大液量或更长运行时间时，单次液滴供液难以持续，必须定期向入口端补液。人工周期性补液过程繁琐，不利于长期实验连续执行。基于此，研究人员设计了一套自动试剂分配系统，以实现对被动泵入口液滴的自动间歇补充，并验证其能否在微流控实验中稳定工作、调节流量并支持长时程细胞培养。

研究人员构建的系统由电动移液器（motorized micropipette）、改装的小型数控平台（CNC router stage）、无线控制板和3D打印固定结构组成。系统通过蓝牙（Bluetooth）远程控制移液和平台移动，实现试剂吸取、定位、分配及废液回收等操作。研究以聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道器件为对象，首先验证自动定位重复性，随后通过不同液滴体积的分配实验测定流量变化，最后以人脐静脉内皮细胞（HUVECs，human umbilical vein endothelial cells）微通道培养实验评价18 h自动补液的可行性。结果表明，该原型系统在2 mm入口孔尺度上具有足够的位置重复精度；入口液滴体积可有效调节初始流速；在18 h自动培养基补充过程中，细胞黏附保持效果与手动加液相当。研究据此认为，自动间歇补液可作为延长表面张力驱动被动泵运行时间的可行手段，并为低成本、低复杂度微流控自动供液提供了概念验证基础。

从方法学上看，研究主要采用了三类关键技术。其一，基于Young–Laplace方程构建表面张力泵驱动机理分析框架，并通过入口液滴体积变化估算流量。其二，利用商用电动移液器、改装CNC二维平台、ESP32无线控制板及3D打印夹具集成自动试剂分配系统。其三，采用PDMS软光刻（soft lithography）制备直线微通道，并以HUVECs在微通道内进行18 h培养验证自动补液功能；样本来源为Takara Bio Inc.提供的pooled HUVECs，第4代细胞。

在研究结果方面，论文首先在“4.1. Accuracy Verification of Automatic Reagent Dispensing System”部分验证了自动分配系统的定位精度。研究人员通过在移液器尖端安装针头，并在微流控器件入口孔上覆盖40 μm定向聚丙烯（OPP）薄膜，利用针头切痕位置反推出分配到达坐标。结果显示，z轴方向误差控制在±50 μm以内；在10次往返运动测试中，二维平均坐标为（?277 μm，?253 μm），标准差分别为221 μm和257 μm，距目标原点最远的标记位于（?284 μm，?782 μm），对应最大位移781 μm。由于该偏差仍处于2 mm直径入口孔范围内，说明系统定位重复性足以满足本研究所用微流控器件的液滴分配需求。研究同时指出，该测试主要验证机械定位能力，尚未全面涵盖液滴脱落、液体铺展、吸头润湿、弯月面形成、飞溅接触、蒸发和长时程累积漂移等实际湿法分配可靠性问题。

在“4.2. Flow Rate Measurement”部分，研究人员考察了不同入口液滴体积对流量的影响。实验中先在出口端加入150 μL蓝色染液，再在入口端分配2~32 μL红色染液，通过微通道内颜色变化确认流向，并以分配后5 s内液滴体积变化估算流量。结果表明，在2~32 μL范围内，流量约为16.3~52.3 μL/min，且呈现以约8 μL为分界的两阶段变化特征：小于8 μL时流量随液滴体积增大而快速上升；大于或等于8 μL后，增长趋势趋缓。研究人员据此分析认为，当液滴体积较大时，重力使液滴难以稳定钉扎于2 mm入口孔边缘，液滴底部向孔外扩展，导致曲率半径增大，继而使由Young–Laplace方程所描述的拉普拉斯压下降，从而减弱入口与出口之间的压差驱动力，流量增加幅度因此变小。该结果说明，通过精确控制入口液滴体积，可以对表面张力泵的初始流动特性进行调节。与此同时，论文也明确指出，本研究只测量了液滴分配后的初始流动行为，尚未对整个补液周期中曲率、驱动力和流量的时间演变进行连续表征。

在“4.3. Cell Culture in a Microchannel Using the System”部分，研究人员利用该系统进行了18 h微通道细胞培养验证，以评估自动补液在生物实验中的实用性。实验选用胶原包被的直线微通道，并接种第4代HUVECs。通过表面张力泵驱动培养基流动，系统每30 min向入口端自动分配10 μL、并从出口端移除相同体积液体，总计执行约36个补液循环，名义累计供液量约360 μL，从而在总体液量近似恒定条件下完成长时程培养。18 h后，研究人员比较了自动补液与手动加液两种条件下的细胞黏附情况。结果显示，二者相对黏附细胞数相近，说明自动补液在维持细胞附着方面可达到与常规手动操作相当的效果。尽管由于实验未在CO₂培养箱中进行，细胞增殖受限，但微通道内细胞数量仍增加约2.6倍，提示自动补液过程中并未引起显著细胞脱落。对照组在标准CO₂培养箱中的35 mm培养皿内细胞数量约增加3.3倍，表明本研究条件更适于验证系统基本功能，而非全面评估最佳生物培养性能。论文据此强调，本实验的意义在于证明18 h自动补液流程能够顺利执行，且在所测试条件下未见堵塞、定位失败、分配失败或程序中断，但尚不能据此建立长期定量流动稳定性和剪切应力特征的完整评价体系。

综合讨论部分可见，研究人员将本工作明确定位为一项概念验证（proof-of-concept）研究。其核心贡献并非对微流控长期培养体系进行全面优化，而在于证明：通过自动间歇补液，可将原本受限于小体积液滴特性的表面张力泵扩展至更长时间尺度的运行。相较于依赖注射泵和蠕动泵的传统方案，该系统减少了复杂连接、人工重复操作及相关污染风险，并在处理潜在危险样本时具有一定应用优势。论文同时谨慎指出，长周期逐次流量变化、湿法分配可靠性、拉普拉斯压时变分析、剪切应力定量表征以及更深入的生物学性能评估，均超出本研究范围，仍需在后续工作中进一步验证。因此，本研究的意义主要在于提出了一种结构简单、成本较低、可远程控制的自动供液平台，为被动泵送微流控系统的长期运行提供了新的实现路径，并为今后在更严格环境控制条件下的拓展应用奠定了实验基础。

研究结论部分可译为：本研究证明了将自动间歇试剂分配与表面张力驱动的被动泵送系统相结合的可行性。所开发的原型系统对所测试微流控器件表现出足够的定位重复性，并能够在18 h细胞培养实验期间实现自动补液。18 h实验中的运行稳定性通过所有预设分配与抽吸循环均顺利完成得到验证。实验期间未观察到堵塞、定位失败、分配失败或自动序列中断。尽管本研究未进行连续流量监测，因此尚无法建立长期流量稳定性的定量结论，但所有计划操作均成功完成，表明在测试条件下自动补液流程能够稳定执行。研究结果支持该方法具有实际应用潜力，但对于长期流动稳定性、湿法分配可靠性、生物学性能及剪切应力特征的系统性验证，仍有待后续研究完成。上述结果提示，所提出系统有助于降低被动泵送系统的操作复杂性，而这在依赖间歇人工操作的传统注射泵系统中通常较难实现。此外，间歇分配机制还有助于降低污染风险，使其适用于危险样本处理。总体而言，该系统为微流控应用中的自动流体处理提供了一个简单、低成本的概念验证平台；未来仍需在更严格受控的环境条件下进一步验证，以拓展其在更广泛实验与运行场景中的适用性。