伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)的异戊二烯化修饰pUS2蛋白促进连接蛋白43(connexin 43, Cx43)磷酸化及缝隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)的抑制

《Journal of Virology》：The prenylated pUS2 protein of pseudorabies virus contributes to phosphorylation of connexin 43 and suppression of gap junctional intercellular communication

　　

缝隙连接细胞间通讯(GJIC)可使相邻细胞间直接传递信号分子，并通过介导旁观细胞防御反应在先天抗病毒免疫中发挥重要作用。研究人员此前发现α疱疹病毒伪狂犬病毒(PRV)通过病毒被膜蛋白pUL46触发ERK1/2介导的主要缝隙连接(GJ)蛋白连接蛋白43(Cx43)磷酸化与降解，从而抑制GJIC。本文中，研究人员鉴定到异戊二烯化(prenylated)病毒蛋白pUS2是PRV感染过程中调控该过程的第二个重要调节因子。利用减毒PRV疫苗株Bartha K61及一系列等基因缺失突变体，研究人员证明pUS2是高效Cx43磷酸化及GJIC抑制所必需的，但其本身并非ERK1/2激活所需。研究人员进一步证实pUS2的该功能依赖于其C端CAAX异戊二烯化基序。异戊二烯化缺陷型pUS2突变体无法将ERK1/2募集至质膜，并因此不能诱导有效的Cx43磷酸化或GJIC下调。本研究数据支持如下模型：PRV采用两步策略抑制感染细胞的GJIC——pUL46触发ERK1/2激活，而新表达的异戊二烯化pUS2将活化的激酶重定向至质膜以促进Cx43磷酸化。本工作揭示了PRV如何通过宿主激酶信号的空间控制来抑制缝隙连接细胞间通讯。

论文解读：伪狂犬病毒异戊二烯化pUS2蛋白通过募集活化ERK1/2至质膜促进Cx43磷酸化及缝隙连接通讯抑制

本研究发表于《Journal of Virology》。

一、研究背景与目的

缝隙连接细胞间通讯(Gap junctional intercellular communication, GJIC)由连接蛋白(connexin)，尤其是含量最丰富的连接蛋白43(Connexin 43, Cx43)组成的缝隙连接(gap junction, GJ)介导，可传递环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)等抗病毒次级信使，是先天抗病毒免疫的重要组分。病毒可靶向GJIC创造有利复制环境。研究人员此前证实野生型伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)被膜蛋白pUL46激活宿主ERK1/2，导致Cx43磷酸化、降解及GJIC关闭，但活化的ERK1/2如何被导向质膜Cx43底物尚不清楚。pUS2是α疱疹病毒保守被膜蛋白，PRV pUS2含C端CAAX异戊二烯化(prenylation)基序使其定位于质膜，且可与活化ERK1/2相互作用。本研究旨在明确pUS2在PRV感染中是否及如何参与Cx43磷酸化与GJIC抑制。

二、主要关键技术方法

研究使用PRV野生型(WT)Becker株、减毒Bartha K61株及其US区回补株Ba43/25a、Becker及Kaplan背景的ΔUS2缺失突变株、US2 CAAX(C→G突变为GAAX)突变株及CAAX回补株；细胞模型为猪睾丸上皮(ST)细胞与大鼠肝上皮WB-F344细胞。主要技术包括： scrape loading-dye transfer(SL-DT)检测GJIC功能；Western blot检测磷酸化Cx43(p-Cx43)、磷酸化/总ERK1/2、pUS2法尼基化；免疫沉淀(IP)验证pUS2法尼基化修饰；共聚焦免疫荧光(IF)观察pUS2、Cx43及ERK2-GFP亚细胞定位；病毒滴度测定(TCID₅₀)评估复制能力。

三、研究结果

The US deletion in the genome of the PRV vaccine strain Bartha K61 contributes to its inability to trigger Cx43 phosphorylation or downregulate GJIC

用WT PRV Becker株与Bartha株感染细胞，Bartha不能像WT那样降低GJIC且Cx43磷酸化受损、ERK1/2激活延迟减弱；将Bartha的US区大片段缺失修复(Ba43/25a株)后，Cx43磷酸化与GJIC抑制表型均恢复。表明Bartha US区缺失(含US2、US7、US8、US9)是其无法诱导Cx43磷酸化及抑制GJIC的原因，US区编码蛋白参与该过程。

The pUS2 protein encoded within the US deletion of Bartha contributes to Cx43 phosphorylation

分别用ΔUS2、ΔUS7/8、ΔUS8、ΔUS9等基因缺失突变体感染细胞，仅ΔUS2突变体Cx43磷酸化显著减弱而ERK1/2激活正常；该表型在Becker与Kaplan双背景中得到验证；Cx43磷酸化起始时间与pUS2表达时间(~2 hpi)吻合。证明pUS2而非其他US区基因是Cx43磷酸化所必需，且不通过影响ERK1/2激活实现。

Prenylation of pUS2 is required for PRV-induced Cx43 phosphorylation and for plasma membrane localization of ectopically expressed ERK2

构建US2 GAAX(异戊二烯化缺陷)突变株与CAAX回补株，二者病毒复制无差异。GAAX突变株Cx43磷酸化减弱；回补株pUS2与Cx43共定位于质膜，GAAX突变株pUS2质膜定位失败且与Cx43无共定位；转染ERK2-GFP后，回补株感染时ERK2-GFP与pUS2共定位于质膜，GAAX突变株感染时二者滞留胞质。表明pUS2依赖CAAX异戊二烯化定位于质膜并将活化ERK1/2募集至质膜，进而促进Cx43磷酸化。

pUS2 prenylation is required for efficient downregulation of GJIC

SL-DT实验显示US2 CAAX回补株感染显著抑制GJIC，而US2 GAAX突变株无此效应。证实pUS2异戊二烯化是PRV有效下调GJIC所必需。

四、讨论与结论总结

讨论指出PRV采用两步策略抑制GJIC：感染早期被膜pUL46激活ERK1/2；新合成的含CAAX基序的pUS2将活化ERK1/2空间募集至质膜缝隙连接处，使其接近底物Cx43促使其磷酸化致GJ通道关闭，阻断抗病毒信使(cGAMP等)向旁细胞传递，利于病毒扩散。pUS2作为病毒编码的ERK1/2信号空间调节因子，不激活ERK1/2但通过异戊二烯化介导其质膜定位偏向膜相关底物磷酸化。Bartha疫苗株因US2缺失丧失该能力，这可能与减毒及免疫原性相关，为理性设计不抑制GJIC的α疱疹病毒减毒活疫苗提供依据。

研究结论翻译：本研究确定pUS2是PRV感染中促进Cx43磷酸化与GJIC抑制的关键因子，其功能依赖C端CAAX异戊二烯化基序。pUS2作用于ERK1/2激活下游，通过将活化ERK1/2募集至质膜使Cx43被磷酸化，从而关闭缝隙连接。该工作揭示PRV通过病毒蛋白调控宿主激酶信号空间分布以破坏细胞间抗病毒通讯的精细机制。