HERPUD1通过招募HRD1降解猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）ORF3蛋白抑制病毒复制

《Journal of Virology》：HERPUD1 suppresses porcine epidemic diarrhea virus replication by recruiting HRD1 to degrade viral ORF3 protein

　　

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）开放读码框3（Open Reading Frame 3, ORF3）基因与病毒致病力相关。既往研究表明PEDV ORF3蛋白定位于内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）并可触发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）。然而，ORF3与UPR通路相关蛋白之间的精确互作及潜在机制仍不清楚。本研究证实ORF3蛋白能够通过激活转录激活因子6（Activating Transcription Factor 6, ATF6）通路和PKR样内质网激酶（PKR-like ER Kinase, PERK）通路诱导ER应激。通过酵母双杂交筛选，研究人员鉴定到HERPUD1与ORF3蛋白相互作用。进一步研究表明，HERPUD1招募E3泛素连接酶HRD1，促进ORF3经内质网相关降解（ER-associated Degradation, ERAD）途径发生泛素化及随后的降解。该过程进而缓解了ORF3诱导的ER应激并抑制PEDV复制。随后研究发现ORF3第61位赖氨酸（Lysine 61, K61）是ORF3降解的关键位点。研究人员构建了ORF3突变重组PEDV（rPEDV-ORF3-K61R）。与rPEDV相比，rPEDV-ORF3-K61R表现出更高水平的ORF3表达，诱导更强程度的ER应激并更有效地抑制干扰素-β（Interferon-β, IFN-β），伴随病毒滴度约0.5 log的增加。综上，本研究表明HERPUD1通过负向调控PEDV ORF3蛋白稳定性抑制PEDV复制，深化了对病毒感染致病机制的理解。

论文解读：HERPUD1通过招募HRD1介导PEDV ORF3蛋白ERAD降解抑制病毒复制

研究背景与意义

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV，α冠状病毒属）引起，可致新生仔猪高死亡率，造成巨大经济损失。PEDV基因组除结构蛋白（S、E、M、N）及非结构蛋白（NSP1-16）外，编码唯一的附属蛋白ORF3（224个氨基酸）。已知ORF3是重要毒力因子，可促进囊泡形成、延长S期助病毒增殖，并能定位于内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）诱导未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）——主要激活PERK-eIF2α通路，同时拮抗I型干扰素（Type I Interferon, IFN-I）信号。然而，宿主是否能反向调控ORF3蛋白稳定性使其降解、以及ORF3与UPR相关蛋白互作的具体机制尚不明晰。HERPUD1是ER应激诱导蛋白，含N端泛素样（Ubiquitin-Like, UBL）结构域，参与内质网相关降解（ER-associated Degradation, ERAD）复合物，可被ATF6转录上调。本研究旨在探究宿主因子HERPUD1是否及如何调控PEDV ORF3蛋白，阐明其抑制PEDV复制的分子机制。该论文发表于《Journal of Virology》。

主要关键技术方法

研究人员采用酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, YTH）筛选猪肺泡巨噬细胞cDNA文库鉴定ORF3互作宿主蛋白；通过共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）和激光共聚焦免疫荧光（Immunofluorescence Assay, IFA）验证HERPUD1/HRD1与ORF3的相互作用及共定位；利用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂氯喹（Chloroquine, CQ）确定ORF3降解途径；构建ORF3各赖氨酸单突及全赖氨酸突变体（K-to-R），结合环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）追踪实验鉴定关键泛素化位点K61；通过siRNA敲低HERPUD1/HRD1及过表达实验验证E3连接酶HRD1的介导作用；利用基于PEDV GX4/2021（GIIa）全长感染性克隆的Red同源重组技术拯救重组病毒rPEDV-ORF3-K61R，进行体外病毒复制、ER应激标志物及IFN-β拮抗功能检测；样本涉及Vero、ST（猪睾丸）、IPEC-J2（猪空肠上皮）细胞及PEDV感染仔猪空肠组织。

研究结果

PEDV ORF3蛋白通过激活PERK和ATF6通路诱导UPR

研究人员证实PEDV感染上调Vero和ST细胞中GRP78、ATF6、PERK、IRE1α的mRNA及蛋白（p-PERK、cleaved ATF6）水平；转染Flag-ORF3可显著升高cleaved ATF6、p-PERK和GRP78，表明ORF3特异性激活UPR的ATF6和PERK分支，而不仅是整体病毒感染效应。

HERPUD1与PEDV ORF3蛋白相互作用

YTH初筛并经Co-IP证实HERPUD1与ORF3相互结合，且该互作在不同PEDV毒株ORF3中保守。共聚焦显示二者在细胞质共定位，且PEDV感染或ORF3过表达可显著上调ST、IPEC-J2细胞及感染仔猪肠道组织中HERPUD1的mRNA和蛋白水平，说明ORF3诱导HERPUD1表达并形成反馈互作。

HERPUD1对ORF3功能的影响

HERPUD1过表达呈剂量依赖性降低ORF3蛋白水平，siRNA敲低HERPUD1则升高ORF3蛋白。MG132（蛋白酶体抑制剂）可逆转HERPUD1介导的ORF3降解，CQ（溶酶体抑制剂）无此效果，表明ORF3经泛素-蛋白酶体途径降解。功能上，HERPUD1过表达降低ORF3诱导的cleaved ATF6和GRP78（mRNA及蛋白水平），siRNA敲低HERPUD1则加剧ER应激，证明HERPUD1通过促ORF3降解缓解ORF3引发的ER应激。

K61是ORF3关键的泛素化位点

ORF3可被泛素化并形成K11-、K48-、K63-连接的多聚泛素链。PEDV ORF3含8个赖氨酸残基，定点突变筛选发现仅ORF3-K61R及全赖氨酸突变体（ORF3-K/R）能抵抗MG132存在下的降解；CHX追踪显示ORF3-K61R半衰期显著长于野生型（Wild Type, WT），且HERPUD1过表达无法促其降解，确认K61是HERPUD1介导ORF3泛素化降解的关键位点。

HERPUD1招募HRD1调控ORF3的泛素介导降解

Co-IP证实ORF3与E3泛素连接酶HRD1互作并共定位。HERPUD1过表达增强HRD1与ORF3结合，敲低HERPUD1减弱该结合；敲低或过表达HRD1分别阻断或促进HERPUD1介导的ORF3降解。HRD1介导ORF3的K63-连接多聚泛素化。表明HERPUD1作为衔接蛋白招募ERAD核心E3连接酶HRD1至ORF3，促其K63-linked泛素化及ERAD降解。

HERPUD1抑制PEDV复制

在ST和IPEC-J2细胞中，HERPUD1过表达显著降低PEDV N蛋白表达及N mRNA水平、抑制rPEDV-GFP-ORF3荧光强度；siRNA敲低HERPUD1则促进PEDV复制，证实HERPUD1是宿主限制PEDV复制的抗毒因子。

rPEDV-ORF3-K61R在体外呈现强复制能力

ORF3-K61R过表达比WT-ORF3更强上调PERK/ATF6 mRNA并更有效抑制Poly(I:C)诱导的IFN-β，说明丧失K61泛素化位点增强ORF3致ER应激及IFN-I拮抗能力。拯救的rPEDV-ORF3-K61R感染细胞中ORF3蛋白表达高于rPEDV；TCID₅₀测定病毒滴度较rPEDV升高约0.5 log；感染细胞PERK/ATF6 mRNA更高，且更显著抑制Poly(I:C)诱导的IFN-β。证明K61位是体内外调控ORF3稳定性及病毒毒力的关键残基。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，PEDV感染诱导ER应激激活UPR（PERK、IRE1α、ATF6），ORF3可激活其中ATF6和PERK分支。通过YTH筛选出ER蛋白加工通路相关分子HERPUD1为ORF3互作宿主因子。HERPUD1被ORF3-ATF6轴上调后，作为衔接子招募ERAD的E3连接酶HRD1至ORF3，介导其K63-连接泛素化并经蛋白酶体降解，减轻ORF3所致ER应激，抑制病毒复制。ORF3仅含8个赖氨酸，K61高度保守（GI/GII群），构建rPEDV-ORF3-K61R因逃避HERPUD1降解致ORF3积累、ER应激增强、IFN-β抑制加强，最终病毒滴度升高。此为首次报道HERPUD1作为限制PEDV复制的新型宿主因子。

研究结论（翻译）：综上所述，PEDV ORF3蛋白诱导ER应激从而激活ATF6通路并上调HERPUD1表达。随后，HERPUD1通过招募E3泛素连接酶HRD1促进ORF3泛素化，并通过内质网相关降解（ERAD）途径使其降解，从而缓解ORF3诱导的ER应激并抑制PEDV复制。本研究首次揭示HERPUD1通过泛素-蛋白酶体途径调控PEDV ORF3降解从而抑制病毒复制的新机制，为理解PEDV致病机制提供了新视角。