靶向H5N1血凝素与基质蛋白2胞外域的VSV载体二价疫苗诱导强效中和及ADCC抗体应答并在小鼠模型中完全抵御致死性H5N1感染

《Journal of Virology》：A VSV-vector vaccine simultaneously targeting H5N1 hemagglutinin and matrix protein 2 induces robust neutralizing and ADCC antibody responses and provides full protection against lethal H5N1 infection in a mouse model

　　

禽流感病毒特别是高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）病毒构成重大公共卫生威胁，多价疫苗是防控此类病毒的主要预防性措施。为研制此类疫苗，研究人员构建了两种同时靶向H5N1血凝素（Hemagglutinin, HA；H505或H522）与基质蛋白2胞外域（ectodomain of Matrix protein 2, M2e）的以水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus, VSV）为载体的候选多价疫苗，并对其诱导保护性免疫应答的能力进行了表征。研究结果显示，疫苗免疫可在小鼠体内诱导针对HPAI HA蛋白和M2蛋白的高水平体液免疫应答。值得注意的是，免疫小鼠血清对相应H5假病毒（pseudovirus）表现出高效中和活性，并能介导针对源自人与禽源流感H5、H1、H3及H7病毒M2e的强效且广谱的抗体依赖细胞介导的细胞毒性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC）活性。此外，V-EtM2e/H522经鼻（Intranasal, IN）及肌内（Intramuscular, IM）免疫均能有效保护小鼠抵御HPAI H5N1病毒攻击，存活率达100%，且多个组织脏器中未检出病毒载量。尤为重要的是，非侵入性黏膜经鼻接种在免疫剂量降低100倍时仍获得与肌内接种等同的保护效果。上述发现为基于VSV的多价疫苗抗人（禽）甲型流感病毒的有效性提供了有力证据。

论文解读：靶向H5N1 HA与M2e的VSV二价疫苗诱导中和及ADCC应答并完全保护小鼠抵御致死性H5N1攻击

本文发表于《Journal of Virology》。

一、研究背景与概述

高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒可跨种属感染人类，存在引发大流行风险，而现有季节性流感疫苗仅靶向HA（Hemagglutinin，血凝素）且株特异性强，难以提供广谱保护；传统鸡胚生产工艺亦不适用于HPAI毒株。因此，研究人员开展本研究以开发一种基于重组水疱性口炎病毒（recombinant Vesicular Stomatitis Virus, rVSV）的二价疫苗，同时在VSVΔG骨架中表达H5N1 HA（分别来自2005年株H5₀₅与2022年株H5₂₂）及融合埃博拉病毒糖蛋白树突状细胞靶向域（Ebola glycoprotein Dendritic cell-targeting domain, EΔM）的四拷贝串联M2胞外域（tetra-M2e, tM2e；人/禽/猪源各一或两拷贝，即EΔM-tM2e，简称EtM2e），旨在同时诱导HA特异性的中和抗体（Neutralizing Antibody, NAb）与M2e保守表位介导的广谱抗体依赖细胞介导的细胞毒性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC）及Fc效应功能。研究结果表明，该疫苗在小鼠模型中成功诱导强效抗HA结合与中和抗体及抗M2e抗体并介导跨亚型ADCC，肌内（IM）与经鼻（IN）免疫均实现100%存活率及攻毒后组织病毒清除，其中IN组仅需IM剂量1/100即获同等保护。该策略整合了亚型特异性中和与保守表位广谱Fc效应功能，为通用型甲型流感疫苗开发提供了依据。

二、主要关键技术方法

研究人员采用反向遗传学技术拯救rVSVΔG双表达载体疫苗株V-EtM2e/H5₀₅和V-EtM2e/H5₂₂（H5 HA弗林蛋白酶切割位点突变为胰酶依赖性以降低毒力）；以6～8周龄雌性BALB/c小鼠进行IM初免—加强免疫评估体液免疫，另以雌雄各半共80只BALB/c小鼠分四组行IN低剂量、IM高剂量疫苗或对照（VSV-EBOVGP）免疫并加强，于第42天用10×LD₅₀HPAI H5N1（A/BC/PHL_2032/2024）滴鼻攻毒；通过ELISA检测抗HA与抗M2e IgG及其亚类；H5假病毒（pseudovirus）—荧光素酶报告系统测定中和抗体ID₅₀；ADCC报告基因分析法（Jurkat–FcγRIV–NFAT–luciferase）及原代NK细胞CD107a脱颗粒实验评估ADCC；攻毒后监测体重与生存，于4 dpi取肺、心、肾、脾以TCID₅₀法测定组织病毒载量。

三、研究结果

Construction and characterization of the VSV vaccines expressing the modified H5N1 HA protein and EboΔM-fused influenza M2 ectodomain

研究人员将密码子优化H5₀₅/H5₂₂（HA弗林切割位点缺失改胰酶激活）与EΔM-tM2e共插入rVSVΔG载体，成功拯救V-EtM2e/H5₀₅与V-EtM2e/H5₂₂。Western blot与免疫荧光证实感染Vero E6细胞可高效共表达HA与EtM2e，证明载体构建正确且抗原表达良好。

V-EtM2e/H5₀₅or V-EtM2e/H5₂₂induced robust anti-HA and anti-M2e IgG antibody responses in immunized mouse serum

IM免疫BALB/c小鼠后，加强免疫后血清抗HA与抗M2e总IgG终点滴度显著升高（抗-HA≈1:3900，抗-M2e≈1:14700），且以Th1型偏向的IgG2a为主。说明疫苗具良好免疫原性，可诱导强烈体液免疫。

Specific recognition of different HA and M2 proteins from various influenza subtypes by vaccine-immunized sera

免疫血清可强结合不同年份H5N1/H5N2 HA，但对H3、H7结合弱，几乎不结合H1，表明HA源性抗体呈H5亚型限制性，符合HA头域高度变异性特征。

The anti-HA sera from V-EtM2e/H5₀₅- or V-EtM2e/H5₂₂-immunized mice induced high levels of specific neutralizing antibodies against H5-pseudovirus infection

免疫血清对同源H5假病毒具高效中和（ID₅₀高值），异源H5₀₅/H5₂₂交叉中和弱，证实中和抗体具株特异性；含M2的假病毒与不含M2者中和效价无差异，提示抗M2e抗体不干扰抗HA中和作用。

Vaccination-induced broad ADCC activity against different influenza M2 proteins

免疫血清识别多种甲型流感（H5N1、H7N9、H1N1、H3N2）及乙型流感M2e，并在ADCC报告系统中介导强且广谱的ADCC活性（对M2_H5N1、M2_H7N9达8～14倍诱导），原代NK细胞共培养实验证实该ADCC由抗M2e抗体通过FcγR激活NK细胞CD107a脱颗粒实现，显示疫苗可诱导保守M2e表位介导的跨株Fc效应功能。

Immunization with V-EtM2e/H5₂₂via either the IN or the IM route efficiently protects mice from lethal H5N1 influenza virus infection

V-EtM2e/H5₂₂经IM（1×10⁷TCID₅₀）或IN（1×10⁵TCID₅₀，为IM剂量1/100）免疫并加强后，小鼠攻毒10×LD₅₀HPAI H5N1（A/BC/PHL_2032/2024）均获100%存活率，体重维持稳定；对照组全部死亡。攻毒后4天，免疫组肺、心、肾、脾脏均未检出感染性病毒（TCID₅₀阴性），雌雄性间无显著差异。表明该疫苗无论系统或黏膜途径均可提供完全保护并清除病毒。

四、讨论与结论总结（翻译浓缩）

本研究构建了共表达HPAI H5 HA与四拷贝保守M2e（融合EΔM树突状细胞靶向域）的rVSV二价疫苗，证实其可诱导强效抗HA中和抗体及抗M2e广谱ADCC抗体。V-EtM2e/H5₂₂肌内与经鼻免疫小鼠均可完全抵御2024年流行H5N1致死攻击，经鼻低剂量即等效于肌内高剂量保护，体现黏膜免疫优势及载体高效性；HA弗林位点突变提高了安全性。HA组分提供株/亚型特异性中和，M2e组分提供跨甲型流感亚型的Fc效应（ADCC）保护潜力。此rVSV多价平台结合了抗原广度与强免疫激活，是开发通用甲型流感疫苗的有力策略。后续需在FcγR缺陷小鼠中解析中和与ADCC各自贡献，并在非人灵长类及其他亚型攻毒中验证广谱性。

综上，V-EtM2e/H5₀₅与V-EtM2e/H5₂₂疫苗候选株可诱导强流感特异性体液与Fc效应免疫，其中V-EtM2e/H5₂₂免疫对致死性HPAI H5N1攻击提供完全保护，通过联合可变HA与保守M2e靶标实现了亚型特异性中和与跨株ADCC保护的整合，突显了rVSV基多价疫苗作为通用甲型流感疫苗平台的潜力。