综述：HCMV感染中的DNA损伤应答：新兴机制与待解问题

《Journal of Virology》：DNA damage responses in HCMV infection: emerging mechanisms and outstanding questions

　　

细胞DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）对于在外源性攻击以及DNA复制过程中引入的错误和断裂压力下维持基因组完整性至关重要。DDR是由多种细胞过程构成的复杂网络，能够识别DNA损伤的类型与严重程度，并协调下游应答。这些应答包括激活特异性DNA修复通路、诱导细胞周期停滞以争取修复时间，以及在损伤不可修复时触发细胞凋亡，以清除基因组受损的细胞。DNA病毒已经进化出多种策略，以逃逸、抑制，甚至劫持宿主DDR因子，从而促进其自身复制。若缺乏此类对抗机制，宿主DDR的激活可迅速将病毒基因组识别为异常DNA，并限制病毒感染。矛盾的是，许多DNA病毒又依赖宿主DDR的多个方面来确保其基因组高效复制。本文聚焦于人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），这是一种具有大型复杂双链DNA基因组的β-疱疹病毒，以及其与宿主DDR之间的关系。尽管HCMV感染了人群中的绝大多数个体，但关于病毒复制如何调控强烈的细胞DDR，或如何将其募集用于自身复制，仍存在基础性认识缺口。此外，DDR在限制病毒DNA（vDNA）复制、促进进入潜伏状态、在细胞增殖期间稳定潜伏基因组，以及在初次感染后或潜伏再激活后促进vDNA合成中的作用，仍然缺乏清晰认识。

INTRODUCTION

文章首先阐述DNA损伤应答（DDR）是维持细胞基因组稳定性的核心机制。DNA损伤既可来源于氧化应激、诱变剂、紫外线、电离辐射和病原体等外源因素，也可在正常细胞增殖过程中产生。不同类型DNA损伤会呈现不同的结构特征，并被持续监视基因组的损伤感知蛋白识别，进而募集相应修复因子。作者进一步指出，病毒尤其是DNA病毒在感染早期将其基因组导入细胞后，可因游离双链末端、缺口或切口而被宿主识别为异常DNA，从而激活DDR；而在病毒DNA复制阶段，vDNA同样暴露于复制错误和修复相关风险之中。因此，DDR既是宿主限制病毒感染的重要防御体系，也可能被病毒利用以支持复制。文章据此引出HCMV与宿主DDR之间复杂而矛盾的相互作用这一核心问题。

DDR PATHWAYS—AN OVERVIEW

本节系统概述DDR的组成与主要修复通路。DDR因子通常分为感知器、转导器和效应器三大类：感知器负责识别损伤DNA结构，转导器主要通过激酶信号放大并传递损伤信息，效应器则直接执行修复。作者依次概述错配修复（mismatch repair，MMR）、碱基切除修复（base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、Fanconi贫血（Fanconi anemia，FA）通路、单链断裂修复（single-strand break repair，SSBR）、非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组（homologous recombination，HR）等机制，并指出跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）与模板转换（template switching，TS）等损伤耐受机制有助于在复制受阻时维持复制叉推进。

作者重点讨论双链断裂（double-strand break，DSB）修复的两大途径。NHEJ在整个细胞周期中均可发挥作用，不依赖同源模板，因此更易出错；其修复过程始于Ku70/80识别断裂末端并招募DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs），随后在Artemis、Pol μ、Pol λ等参与下进行末端加工，最终由XRCC4-LigIV-XLF复合体完成连接。相较之下，HR主要在S期和G₂期进行，依赖姐妹染色单体作为模板，因此具有更高保真性。其过程涉及MRN（Mre11-Rad50-NBS1）复合体激活共济失调毛细血管扩张突变蛋白激酶（ataxia telangiectasia mutated，ATM），并通过末端切除生成单链DNA（ssDNA），由复制蛋白A（replication protein A，RPA）包被后，再在BRCA1-BRCA2-PALB2协调下由RAD51介导同源搜索与链侵入。作者同时指出，ATR（ataxia telangiectasia and Rad3-related）通路主要响应长段ssDNA和停滞复制叉，并通过ATRIP、9-1-1复合体、Rad17和TOPB1等实现激活，最终磷酸化Chk1以诱导检查点反应。尽管ATM、ATR与DNA-PK常被作为不同通路讨论，但它们在底物和功能上存在显著交叉。

DNA VIRUSES AND HOST DDR

本节将HCMV置于DNA病毒与宿主DDR相互作用的更广泛背景中进行讨论。作者指出，不同DNA病毒具有多样化的基因组结构和复制方式，但普遍会在感染过程中激活宿主DDR感知与转导模块。腺相关病毒（AAV）、人乳头瘤病毒（HPV）、多瘤病毒以及不同疱疹病毒均可不同程度激活ATM和/或ATR信号。与此同时，许多病毒又主动募集DDR组分服务于自身vDNA复制。例如HPV依赖宿主DDR因子和宿主DNA聚合酶完成复制；HSV-1在核内进入后募集部分宿主修复因子，但同时通过即时早期蛋白ICP0降解DNA-PKcs和多个内在免疫或DDR相关因子，以避免宿主限制并维持有利于复制的基因组状态。

作者特别强调，病毒与DDR的关系不仅体现在急性感染复制，也体现在潜伏建立与维持。以HSV-1和KSHV为例，DNA-PK和ATM参与病毒基因组环化并影响潜伏建立效率。由此可见，病毒选择性募集或拮抗宿主DDR组分，可能直接影响复制状态与潜伏状态之间的转换。此外，病毒劫持DDR常伴随宿主基因组稳定性受损，例如诱发DSB、微核形成、DNA:RNA杂交异常与染色体畸变等。这些现象提示，DDR激活究竟主要代表宿主抗病毒防御，还是被病毒定向重编程以促进复制，需要结合具体病毒和感染阶段加以分析。作者据此提出，HCMV在这一问题上仍存在尤其显著的知识空白。

HCMV

本节概述HCMV的生物学背景。HCMV即人疱疹病毒5型，是一种广泛流行并能在人体内长期持续存在的疱疹病毒。与所有疱疹病毒一样，HCMV能够建立终身潜伏感染，而感染结局是进入裂解复制还是潜伏，强烈依赖于被感染细胞类型。成纤维细胞通常支持高效产毒性感染，是研究HCMV复制的常用模型；内皮细胞和上皮细胞也可支持较低水平的持续复制；造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPCs）和髓系细胞则被认为是主要潜伏库。作者指出，HCMV基因组在潜伏期间如何维持、在细胞分裂时如何稳定传递、以及再激活时如何重新进入复制，仍缺乏充分机制解释，这也使DDR在不同感染阶段中的作用成为关键研究方向。

VIRAL GENOME SYNTHESIS

本节围绕HCMV基因组结构与复制机制展开。HCMV具有约236 kb的线性双链DNA基因组，包含独特短区（US）和独特长区（UL），两侧为长反向重复序列，可发生异构化。作者指出，尽管HSV-1的异构化被认为与HR和DSB有关，HCMV是否采用类似机制尚未明确。HCMV编码一套与真核DNA复制机器功能相似的病毒蛋白，包括DNA聚合酶UL54、过程性因子UL44、单链DNA结合蛋白UL57以及解旋酶-引物酶复合体UL105-UL102-UL70，但这些核心因子如何与宿主因子协同完成全基因组复制，机制仍不清晰。

病毒基因组进入细胞核后，会先与PML核体/核域10（nuclear domain 10，ND10）相关联。ND10包含PML、hDaxx、SP100和ATRX等宿主限制因子，可通过组蛋白H3.3装载及H3K9me³相关异染色质化抑制主要即时早期启动子（major immediate-early promoter，MIEP）活性。为解除这种限制，HCMV编码蛋白破坏ND10结构，从而为早期转录和后续复制创造条件。关于复制起始，作者指出HCMV仅有一个已鉴定裂解复制起点（oriLyt），其结构复杂且范围较大。由于单一复制起点需要应对超大基因组复制，复制叉停滞及复制压力应当频繁发生，但宿主DDR在解决这些问题中的作用仍知之甚少。

作者进一步介绍，UL112-113编码的磷蛋白通过内在无序区介导液-液相分离，形成前复制灶并最终发展为病毒复制区室（viral replication compartment，vRC）。在vRC中，病毒和宿主蛋白被集中组织以执行vDNA合成、转录与RNA加工。UL84与IE2可识别oriLyt附近的G-四链体（G-quadruplex，G4）结构，提示该二级结构可能参与复制起始调控。UL114作为尿嘧啶-DNA糖基化酶参与纠正胞嘧啶脱氨或错误掺入产生的尿嘧啶。SUN1、肌动蛋白和微管则参与核内空间重塑，使vDNA与宿主异染色质分离并优化vRC形成。

对于HCMV复制模式，传统观点认为其先以θ型复制启动，随后转为滚环复制以大量生成头尾相连串联体。然而作者指出，这一模型的直接证据仍不足，且HSV-1研究已对“复制前必须环化”以及“滚环复制占主导”的传统假说提出挑战。HCMV感染中也检测到高分子量vDNA，但其究竟代表环状分子、串联体，还是包含大量分支的重组/修复中间体，尚不能确定。作者据此强调，需要采用更直接的方法解析HCMV复制期间基因组构象及宿主DDR在其中的作用。

HOST FACTORS RESPONDING TO HCMV INFECTION

本节总结HCMV感染后被募集至vRC或参与病毒复制的宿主因子。作者提出，HCMV线性基因组的双链末端以及可能存在的切口和缺口，均可触发宿主DDR。多聚ADP-核糖聚合酶1（poly[ADP-ribose] polymerase 1，PARP1）在感染早期被激活，并转位至胞质；在PARP1缺失细胞中，I型干扰素反应增强，提示PARP1具有抑制抗病毒反应的作用。类似机制在HSV-1中已与cGAS的ADP-核糖基化抑制相关联，因此HCMV中PARP1胞质转位也可能具有相似功能。

作者随后讨论G4结构在HCMV中的潜在意义。HCMV基因组富含G-C序列，在启动子、重复区和oriLyt内均可形成G4。G4既可能阻碍复制叉前进、诱发重组，也可能作为复制与转录调控元件。KSHV中RecQ1解旋酶依赖G4参与oriLyt解旋，而HCMV的oriLyt关键区域ER1中的G4同样对vDNA复制起始必不可少；IE2和UL84可直接结合该结构，提示其可能作为特异性识别位点募集病毒或宿主复制因子。除复制外，不同启动子中的G4对病毒转录还可产生正负双向调节效应。

在宿主DDR因子定位方面，iPOND等实验显示多种DDR蛋白与新生vDNA相关。NER组分如CSB、XPD和XPG可募集至vRC；ATM信号被激活，其底物γH2AX定位于vRC；MRN复合体、p53、Chk1、Chk2和ATRIP亦出现在vRC中。与之相对，DNA-PK和ATR在产毒性感染晚期被排除在vRC之外。这些结果提示HCMV偏向利用ATM介导的DDR，而ATM抑制会降低病毒产量，但其促进复制的具体机制尚不明确。作者也指出，尽管DNA-PK晚期不在vRC中，它仍可能在核进入后早期参与基因组环化，尤其与潜伏相关。

随后，作者详细讨论宿主TLS聚合酶在HCMV复制中的作用。尽管HCMV编码自身DNA聚合酶UL54，病毒仍募集TLS聚合酶η、ι和κ至vRC。它们在跨越DNA损伤、避免复制叉停滞方面具有经典作用，同时会增加单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）。mUb-PCNA对这一过程必不可少。值得注意的是，干扰TLS聚合酶或Pol ζ不仅改变SNV水平，还会显著增加HCMV基因组倒位、缺失和重复等重排，且这些事件多发生于G-C富集和重复区域。由此推断，TLS聚合酶除经典跨损伤复制外，还可能通过非经典方式抑制与HR相关的重排或相关DNA病变。文章据此强调，仅仅记录DDR是否被激活并不足够，更重要的是直接分析其对vDNA完整性和遗传多样性的影响。

本节最后还指出，HCMV对DDR的重定向可能以牺牲宿主基因组稳定性为代价。部分细胞在感染后仍持续分裂，可能更易暴露于病毒诱导的DNA损伤和修复失衡。文中提及IE1可促进着丝粒DNA扩增并激活cGAS-STING信号，HCMV还与特定染色体断裂及先天性感染相关听力损伤有关。此外，病毒在感染细胞中可优先修复vDNA而非宿主DNA。与此同时，UL35、USP7、Cullin 4A相关E3泛素连接酶复合体以及BCLAF1等互作网络也提示蛋白稳态和泛素化调控参与了HCMV相关DDR重塑。

VIRUS-HOST INTERACTIONS IN REGULATING HOST DDR FOR VIRUS REPLICATION

本节聚焦HCMV如何通过病毒蛋白主动调控宿主DDR以利于复制。感染早期，pp71进入细胞核并促使hDaxx蛋白酶体降解，从而破坏hDaxx-ATRX限制复合体并解除MIEP抑制；IE1则结合PML并阻止其SUMO化，干扰SUMO依赖蛋白募集，进一步拆解ND10介导的抗病毒屏障。作者同时指出，ATRX并未被HCMV直接清除，其染色质重塑作用可能在控制vDNA扩增幅度和促进基因组包装成熟方面具有双重意义。在潜伏易感细胞中，hDaxx和ATRX复合体保留更完整，从而有利于维持抑制性染色质和潜伏状态。

作者进一步强调，ND10拮抗发生于高度组织化的核内空间背景下。类似HSV-1中的PML“笼状”结构，IE1缺失型HCMV感染可诱导包裹vDNA和核衣壳的PML cage，其形成依赖干扰素信号和ATM介导的DDR，且与γH2AX高度共定位。这说明ATM依赖的DDR不仅可能支持复制，也可作为抗病毒机制。与此同时，IE1还可促进FEN1磷酸化；FEN1既参与冈崎片段加工，也可在停滞复制叉重启中诱导DSB，因此其对HCMV最优复制是必需的，提示HR介导的复制叉修复可能参与HCMV复制过程。

此外，潜伏相关蛋白UL138通过与USP1-UAF1去泛素化复合体相互作用，调控PCNA、FANCD2和FANCI单泛素化相关网络。USP1、PCNA和FANCD2均被募集至vRC。作者指出，UL138不仅通过该通路维持病毒基因组完整性、抑制大规模重排，尤其是与重复序列相关的倒位，还可能通过USP1-RAD51AP1或EGFR-DNA-PKcs轴影响HR与NHEJ等DSB修复通路。整体而言，本节揭示HCMV并非单纯激活或抑制DDR，而是通过多层次、阶段特异性的病毒-宿主互作，精细重编程DNA修复网络以平衡复制效率、基因组稳定性与感染状态转换。

VIRUS-HOST INTERACTIONS IN CONTROL OF THE CELL CYCLE THROUGH DDR PATHWAYS

本节讨论HCMV如何借助DDR相关机制重塑细胞周期环境。作者指出，DNA修复与细胞周期调控紧密耦联，ATM/ATR激活可触发G₁、S期或G₂停滞，而不可修复损伤将诱导凋亡。HCMV则诱导一种有丝分裂原样反应，使细胞进入有利于DNA合成和核苷酸供应的G₁/S样状态，但阻断其真正完成S期和进入有丝分裂，从而为vDNA复制创造条件。IE1可激活ATM并促进p53磷酸化，IE2则通过促进MDM2降解稳定p53。然而尽管感染过程中磷酸化p53升高，p21表达却下降，说明HCMV选择性抑制p53在宿主基因组上的转录功能。IE2、IE1、UL44、UL29/28和UL38等蛋白均可调节p53活性，而p53本身又对高效病毒复制必不可少，提示HCMV对p53采取的是“保留有利功能、抑制不利输出”的精细调控策略。

在RB-E2F轴方面，HCMV通过多种蛋白协同解除RB家族对E2F转录因子的抑制。IE1促进p107和p130高磷酸化并激活E2F1-3；IE2进一步促进pRB磷酸化并作为E2F响应启动子的转录共激活因子；pp71促使RB家族蛋白降解；UL97则通过磷酸化RB家族成员减轻其抑制作用。作者指出，E2F1不仅促进DNA复制相关基因表达，也是ATM/ATR底物，并具有非转录性DNA修复功能，可募集NBS1、Rad51和RPA等修复因子至DSB位点。HCMV即时早期蛋白异位表达可诱导宿主基因组γH2AX灶形成，且这一过程依赖E2F1，提示病毒通过重编程RB-E2F网络，不仅激活宿主复制和修复资源，也可能引发宿主DDR。总体来看，HCMV通过操纵HR相关信号、p53通路和RB-E2F轴，使细胞维持在有利于病毒复制而不利于细胞正常分裂的状态。

CONCLUSIONS AND FUTURE DIRECTIONS

在总结部分，作者强调DNA病毒长期以来一直是分子生物学研究的重要模型，而当前已普遍认识到，DNA病毒会深刻改变宿主细胞周期与DNA修复蛋白的丰度、定位及功能。然而，对于HCMV如何精细调控并劫持宿主DNA修复过程，以及这些事件如何影响vDNA复制、潜伏建立和潜伏维持，仍有大量关键问题未解。作者特别指出，宿主DDR不仅参与限制感染，也参与维持病毒基因组保真性，这为将DDR视作潜在抗病毒治疗靶点提供了依据。

文章进一步提出，DNA损伤与异常修复会对人体健康造成从肿瘤到衰老等广泛影响。尽管HCMV在肿瘤发生中的直接作用尚不明确，但其“肿瘤调节性（oncomodulatory）”已受到广泛关注。病毒为保障自身复制和基因组稳定性而重编程宿主DDR，可能连带损害宿主基因组，尤其是在感染后仍继续分裂的细胞中。因此，阐明HCMV对宿主DDR的调控是否会实质性影响宿主基因组稳定性，是未来重要方向。作者还指出，诸如FA、TLS、HR和NER等多条通路在细胞内本就高度耦联，HCMV恰好为研究这些通路的整合调控提供了独特模型。由于HCMV感染具有较高同步性、可在生长停滞细胞中诱导DNA合成且病毒基因组易于遗传操作，该系统对于解析宿主DDR如何被常见人类病原体重编程具有显著实验优势。