《Journal of Virology》：RIG-I–dependent sensing of PEDV shapes epithelial antiviral immunity in the intestinal mucosa
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猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高传染性肠道冠状病毒，可引起新生仔猪致死性腹泻，但启动黏膜抗病毒免疫的病毒病原体相关分子模式（PAMPs）至今仍不明确。本研究整合肠道单细胞转录组学与体内外感染模型，系统阐明了PEDV被宿主先天免疫系统识别的分子机制。研究人员
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高传染性肠道冠状病毒，可引起新生仔猪致死性腹泻，但启动黏膜抗病毒免疫的病毒病原体相关分子模式（PAMPs）至今仍不明确。本研究整合肠道单细胞转录组学与体内外感染模型，系统阐明了PEDV被宿主先天免疫系统识别的分子机制。研究人员发现，RIG-I（视黄酸诱导基因I）而非MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）是肠道黏膜中检测PEDV并启动干扰素介导抗病毒防御的主要胞质感知因子。RIP-seq（RNA免疫共沉淀测序）与RNA结构分析鉴定出PEDV基因组5′端ORF1a区第375-760位核苷酸为核心RNA PAMP，可被RIG-I直接识别。分子对接与突变分析进一步揭示，特定核苷酸基序与协同性茎环组装对RIG-I的最佳激活至关重要，确立了高级别RNA结构作为PAMP效力关键决定因素的功能地位。该PEDV来源的RNA PAMP可有效激活RIG-I信号通路，放大干扰素及ISG（干扰素刺激基因）应答，并限制PEDV及多种异源RNA病毒的复制，表现出针对多种肠道和呼吸道RNA病毒的广谱抗病毒活性。此外，该病毒RNA与灭活流感疫苗联合使用可显著增强抗原特异性免疫与保护效果。综上所述，这些发现明确了RIG-I介导PEDV识别的分子基础，鉴定了一种兼具抗病毒和佐剂特性的结构性编码病毒PAMP，并为冠状病毒在黏膜表面的感知与控制机制提供了新见解。
本研究旨在阐明猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中，宿主先天免疫系统如何在肠道黏膜层面识别病毒并启动抗病毒防御。PEDV属于α冠状病毒属，是导致全球养猪业重大经济损失的重要病原体，其感染新生仔猪后引发急性水样腹泻，病死率可接近100%。尽管现有研究已表明肠道黏膜中的模式识别受体（PRR）介导的干扰素信号在PEDV感染早期识别、清除病毒及疾病进展中起核心作用，但PEDV的主导性感知受体、关键PAMP特性及其信号放大机制此前尚未明确。研究人员整合已公开的仔猪空肠单细胞RNA测序数据集与自主研发的体内外感染模型，系统解析了PEDV被宿主识别的分子机制。
研究人员开展了以下系列研究并得出相应结论：首先，通过重新分析PEDV口服感染仔猪空肠的单细胞转录组数据，发现RLR（RIG-I样受体）通路在感染后显著富集，且这种富集主要发生在肠上皮细胞中。随后的仔猪口服感染模型验证显示，PEDV感染后空肠和回肠的RIG-I转录水平显著上调约2-3倍，而MDA5在空肠下调、回肠不变；免疫荧光染色证实RIG-V.name**在体内和体外均被诱导表达于PEDV抗原阳性的上皮细胞中。这些结果表明PEDV感染主要通过上皮细胞的RIG-I信号通路感知。
为明确RIG-I的功能地位，研究人员在MARC-145细胞（猴肾来源的PEDV敏感细胞系）中建立了稳定的RIG-I敲低和过表达体系。RIG-I敲低使OASL、OAS2、ISG15、ISG56和IFN-β（干扰素-β）等抗病毒基因转录显著抑制，同时PEDV的N基因转录、N蛋白表达及病毒滴度均明显升高；相反，RIG-I过表达则显著增强ISG激活并降低病毒复制水平。而MDA5敲低对病毒复制无显著影响，表明RIG-I而非MDA5是PEDV的主要胞质感知因子。
进而，研究人员通过RIP-seq技术绘制了RIG-I与PEDV基因组的互作图谱，发现RIG-I结合在5′端ORF1a区域（第375-1900位核苷酸）高度富集，其中第375-760位核苷酸区段呈现最显著的峰值。核苷酸组成分析显示A/C和A/G富集基序的特征。功能筛选证实该375-760 nt片段具有最强的免疫刺激活性，其诱导IFN-β转录和分泌的能力与全长375-1900 nt片段相当，且显著强于Poly(I:C)（聚肌胞苷酸，双链RNA类似物）。该片段在RIG-I敲低细胞中无法诱导干扰素应答，且RNA pull-down实验证实其与RIG-I的C末端结构域（CTD）直接结合，而不与N端CARD结构域或解旋酶结构域结合。猪肠道类器官模型中的验证实验与之一致。
为揭示RIG-I识别PEDV PAMP的结构基础，研究人员进行了分子对接和分子动力学（MD）模拟。Rosetta自由能分析显示RIG-I与该PAMP的结合能为-32.7 kcal/mol，717-744 nt区域与RIG-I的ARG-7、THR-354、ARG-869等关键残基形成氢键和盐桥。MD模拟显示复合物在40 ns后趋于稳定，RMSD（均方根偏差）值稳定在约1.3 nm，氢键数量在35 ns后维持在20-28个。结合自由能分解表明范德华相互作用（-180.24 kcal/mol）为主要驱动力，静电相互作用（-56.97 kcal/mol）贡献显著。虚拟饱和突变分析发现G740突变为U时结合自由能增加最大，表明该核苷酸对复合物稳定性至关重要。RNA pull-down实验证实717-744 nt片段可与RIG-I及其CTD直接结合，而G740突变 abolishes 该相互作用。然而，单独的717-744 nt结合片段不足以诱导干扰素产生。
RNA二级结构预测显示375-760 nt区域包含三个保守的茎环结构（SL1、SL2、SL3）。功能分析表明，单个茎环（SL1、SL2或SL3）均不能有效激活RIG-I或诱导IFN-β表达；而双茎环组合（SL1-2或SL2-3）可使RIG-I转录增强10-20倍、IFN-β表达增强100-200倍。共转染不同单茎环可部分重现这种协同效应。这表明RIG-I激活不仅需要RNA结合，还需要多个茎环结构的协同作用以实现有效的下游信号转导。
在广谱抗病毒活性评估方面，PEDV PAMP预处理使PEDV感染的MARC-145细胞中病毒N基因转录和蛋白表达降低约70%。在猪ST细胞中，该PAMP对TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）和PDCoV（猪δ冠状病毒）的抑制率超过90%。在人A549细胞中，H1N1（A/PR/8/34株）的HA（血凝素）mRNA和蛋白水平降至对照的约50%。体内实验中，小鼠经静脉或肌肉注射PAMP后，血清IFN-β和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）水平显著升高，脾脏和肺脏中RIG-I、IFN-β及多种ISG强烈上调，肌肉注射诱导最强效应。仔猪肌肉注射PAMP后24小时内血清IFN-β显著升高，空肠和回肠中RIG-I和IFN-β转录明显上调，表明该PAMP可同时激活全身和黏膜先天免疫通路。
在PEDV攻毒保护实验中，来自江苏省南京种猪场、经检测对PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、PDCoV、PEDV和TGEV均为阴性的3日龄杜洛克×长白×大白杂交仔猪被分为mock组、PBS组、Poly(I:C)组和PAMP组。PAMP预处理组仔猪在口服PEDV攻击后，粪便评分显著优于PBS组（正常至轻度软便，无水样腹泻），临床表现和肠道大体形态接近正常，组织学检测显示绒毛萎缩和上皮损伤显著减轻，免疫荧光和分子检测证实病毒抗原、N基因RNA及蛋白水平均明显降低，保护效果与Poly(I:C)相当。
在疫苗佐剂效应评估中，研究人员采用全病毒灭活流感疫苗（WIV）免疫BALB/c小鼠模型，设置了mock组、PBS组、WIV组、WIV+Poly(I:C)组和WIV+PAMP组。WIV+PAMP联合免疫组在所有小鼠均存活于H1N1攻击，体重稳定且无临床症状，而单独WIV组有约15%体重损失和约30%死亡率。组织学显示WIV+PAMP组肺组织结构近正常，仅见轻微充血和散在单核浸润。该组血清IFN-β水平较单独WIV组提高约3.2倍，总IgG提高约2.5倍，中和抗体滴度提高约2个对数单位。支气管肺泡灌洗液中IFN-β和IgG水平同样显著升高。肺组织中RIG-I和IFN-β转录增加2-3倍，流感HA mRNA和蛋白丰度降低超过70%，表明PEDV PAMP作为强效RIG-I激动剂可增强灭活疫苗诱导的免疫保护。
在讨论部分，研究人员指出既往RLR研究多基于简化的体外系统，无法重现黏膜感染的细胞和空间复杂性。本研究通过整合单细胞转录组学与体内外模型，明确了RIG-I在PEDV感染肠道黏膜中的主导性感知作用。生理状态下RIG-I在上皮细胞低表达、感染后快速诱导的模式，实现了免疫监视与耐受的动态平衡，避免了对共生或非致病性RNA的不适当激活，同时为适应性免疫启动争取了时间优势。MDA5在PEDV感染中可能扮演旁观者角色，这种功能分化源于配体特异性：MDA5优先识别长双链RNA，而PEDV复制主要产生短至中等长度的双链RNA片段，更适合被RIG-I识别。
RIP-seq揭示的5′ ORF1a区域富集现象与其他RNA病毒不同：PRRSV通过3′UTR被感知，流感病毒暴露锅柄状结构，黄病毒则依赖高度结构化的5′端，而PEDV通过早期暴露的ORF1a转录本 engage RIG-I，反映了不同RNA病毒的复制策略和免疫逃逸机制差异。研究人员特别指出，尽管存在有效早期感知，PEDV仍通过nsp1阻断IRF3激活、nsp15降解双链RNA限制RIG-I配体、ORF3抑制干扰素产生等多种免疫拮抗策略建立黏膜感染。
关于结构-功能关系，研究强调了"结合不足以激活"的原则：717-744 nt片段虽能稳定结合RIG-I，但无法诱导干扰素产生，表明需要高级别RNA结构来解除RIG-I自抑制状态。这一发现与PRRSV中3′UTR假结与相邻双链RNA协同、HCV（丙型肝炎病毒）中poly-U/UC tract与短双链RNA配对等激活模式相呼应，揭示了RNA病毒通过复杂RNA结构平衡免疫识别与逃逸的进化策略。
在佐剂应用前景方面，研究人员将PEDV PAMP与经典TLR靶向佐剂进行了对比：LPS（脂多糖，TLR4配体）毒性强，其衍生物MPLA安全性提高但效力降低；CpG ODN（TLR9配剂）增强体液免疫但细胞应答有限且依赖宿主免疫环境。PEDV PAMP作为病毒来源的RIG-I配体，通过模拟自然感染激活RIG-I-MAVS轴，诱导强烈干扰素和ISG表达，建立持久细胞内抗病毒状态。研究还提出，鉴于RIG-I信号在促进树突状细胞成熟、I型干扰素产生及细胞毒性T细胞 priming 中的核心作用，该PAMP可能促进更高效的抗原呈递和Th1偏倚的细胞免疫应答，未来需系统评估CD4+和CD8+ T细胞应答以明确其作为双重作用佐剂的潜力。
研究结论指出，通过整合肠道单细胞转录组学与体内外感染模型，研究人员证实RIG-I是PEDV黏膜防御的关键决定因素。RIG-I在生理稳态下主要由黏膜单核细胞表达、上皮细胞表达极低，感染后在上皮细胞中迅速上调并激活下游干扰素通路发挥抗病毒效应。RIP-seq进一步鉴定PEDV基因组5′ ORF1a区域是RIG-I的主要靶点，其特定的核苷酸偏好和稳定二级结构构成了作为关键PAMP的分子基础。重要的是，RIG-I激活具有构象依赖性：单个茎环不足以触发信号，而双或多茎环组装显著增强免疫应答，揭示了有效激活需要高级别RNA结构。功能上，该PEDV PAMP不仅通过RIG-I-MAVS轴限制多种RNA病毒复制，还增强先天和适应性黏膜免疫，突显其作为新型免疫佐剂的潜力。这些发现深化了对冠状病毒在黏膜表面感知机制的理解，为利用PRR通路进行抗病毒靶点发现和下一代黏膜疫苗的理性设计提供了概念框架。
